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1、最新CB933100基于纳米技术的肝癌早期诊断的研究项目名称：基于纳米技术的肝癌早期诊断的研究首席科学家：张宁 天津医科大学起止年限：2011.1至2015.8依托部门：天津市科委二、预期目标1. 总体目标 采用纳米材料、微纳加工技术和生物医学研究的最新成果，研究肝癌特异性功能化纳米材料；探索用于肝癌血清检查的微流控芯片的构建和纳米传感新材料的应用；开发基于新型纳米材料的用于肝癌诊断的医学分子影像新技术；临床验证早诊芯片和纳米分子影像新技术，从而为提出和建立国际肝癌早诊新规范奠定基础。本项目将在纳米医学应用、肝癌早期诊断领域取得一批重要成果，培养一批具有国际影响的学术带头人，为大规模、实时、现

2、场肝癌普查提供高性能的新器件，提高肝癌早诊的灵敏度和准确性，提高我国纳米生物医药技术的国际竞争力，造福广大癌症患者。2. 五年预期目标（1）突破性进展 通过本项目的实施，将在肝癌的影像学和体外诊断的理论、材料、方法和技术等方面取得突破性的进展： 实现肝癌诊断功能化纳米材料的按需构筑，在构筑技术上取得突破，为研制微流控芯片生物传感器提供设计思路和技术支持； 将微纳器件和微纳加工技术应用于肝癌检测，建立小型、便携、个体化的肝癌实时诊断平台，推动肿瘤诊断进入POCT（Point of Care Testing）时代； 根据纳米微泡造影剂的声学特性，研究新型靶向纳米微泡造影剂和基于纳米级微泡造影剂的超

3、声成像技术，探索其在肝癌早期辅助诊断中的应用；制备肝靶向的对比剂SPIO及钆，探索其在肝癌早期肝癌MRI诊断检测中的应用；联合肝癌的影像学早诊和血清早诊，实现高灵敏度的实时诊断，争取制定一套肝癌早期诊断的新标准，造福广大肿瘤患者； 采用纳米检测新技术，在肝癌发生和微转移等过程的分子机理研究方面实现突破。 （2）研究成果 获得对肝癌血清标志物具有敏感性和靶向性的新型功能纳米传感材料4-5种； 完成2-3个基于微纳技术的肝癌早期诊断微纳器件，提高检测灵敏度，减少血样分析时间，降低血样和试剂用量，力争其中1-2个器件直接应用于临床； 获得拥有自主知识产权，具有潜在应用价值，且能用于肝癌早期诊断的超声

4、及磁共振造影剂3-5种； 取得一批具有国际影响的原创性成果，在国际重要学术刊物上发表高质量论文80篇以上，申请专利45-50项，计算机软件著作权1-2项； 培养一批具有国际影响力的中青年学术带头人和学术骨干，培养硕士研究生45名，博士研究生30名及博士后10名。三、研究方案1. 学术思路：重点针对“肝癌的早期诊断”这个关键科学问题，设计、构建及优化纳米材料，应用于一个对象（肝癌）早期诊断的两类方法（血清学筛查、影像学诊断），重点研究相关的四个内容：新型功能性纳米材料构筑、纳米传感微纳器件的研究、靶向纳米对比剂及成像技术研究、纳米技术的生物医学应用，达到应用于肝癌早期诊断方面的一系列创新（纳米传

5、感微流芯片、超声及磁共振靶向纳米对比剂、纳米功能成像、早期诊断新模式），实现项目的最终目标（肝癌的早期诊断），促进肿瘤早期检测、活体内肿瘤显像的发展，争取实现肝癌早期诊断与筛查的一套新标准。（见图1）图1 项目总体学术思路2. 技术途径： 本项目将采用多学科相互交叉、渗透和有机结合的模式，以建立新的肝癌早期诊断方法，改善诊断的灵敏度和准确率，实现实时诊断为目标，通过合成新的针对肝癌早诊的功能性纳米材料，应用于肝癌影像学和体外早期诊断：设计、构建以功能性纳米材料为基础的高灵敏度的可控微纳器件，用于血清学早期诊断；在功能性纳米材料的基础上，建立新的影像学成像原理、新的生物信息提取和图像重建技术，用

6、于影像学早期诊断。然后将得到的新的微纳器件和新的造影技术进行系统的医学验证，探索新的肝癌检诊规范化模式，制定一套肝癌早诊应用流程指南。详细技术途径见图2。图2 基于纳米技术的肝癌早期诊断的研究的技术途径具体研究方案：2.1肝癌早期诊断用新型功能性纳米材料的设计和构筑基于纳米效应和生化反应特异性原理，设计、构筑对肝癌标志物具有高度选择性、敏感性和靶向性的新型功能性纳米传感和造影材料；根据肝癌血清学及影像学早期诊断的要求，研究功能性纳米材料的按需构筑方法，为课题二、三提供可靠的材料与技术支持，具体研究方案如下：（1）肝癌血清标志物/肝癌细胞表面标志物的筛选与验证 筛选、验证能够反映肝癌发病状况的标

7、志物抗体。选取天津医科大学附属肿瘤医院接诊的肝癌患者血清500例（均未接受任何治疗），以正常健康志愿者，肝炎患者血清做对照，分析验证血清中标记物联合检测对肝癌诊断的意义。利用酶学方法检测谷氨酰转移酶同工酶GGT-、AFU；电化学发光法检测AFP、CEA、CA19-9；利用ELISA法检测IL-2、IL-10、IL-12、IFN-、IGF-、TNF-、IL-6、CCL15、IL-8；利用流式细胞仪检测GPC3、HAb18G、Hep Par 1、抗原p230。最后通过ROC曲线分析确定几种血清标记物联合检测提高肝癌的诊断敏感性和特异性，为后续联合功能性纳米材料实现肝癌早期诊断奠定基础。 对比、研究

8、单一或多个标志物含量与肝癌出准确率的关系，确定能够用于肝癌血清学及影像学早期诊断的标志物检测方案。（2）功能纳米传感材料的设计、构筑与性能研究 纳米材料的制备与表征：采用溶胶-凝胶法、自组装法、化学和电化学法以及结晶生长等技术，制备纳米金、量子点和导电聚合物纳米粒(聚吡咯、聚苯胺)；采用化学气相沉积法、模板法、化学和电化学法等方法制备阵列碳纳米管、导电聚合物纳米管、氧化锌、氧化锡及硅纳米线；结合各种纳米材料的性能优势，进行组合设计，制备复合纳米材料，如碳纳米管与胶体金或量子点的复合；对上述纳米材料的形态、结构特征及理化性质进行表征。2 生物活性组分与纳米材料的耦合：采用吸附、包埋、共价键合、交

9、联固定、夹心以及LB膜等技术将能与肝癌标志物特异性结合的单克隆抗体或受体等生物活性组分耦合于上述纳米材料表面；考察耦合生物活性组分的纳米传感材料与底物分子的相互作用机制、相关动力学及生物学性质，开发对肝癌早期标志物具有高度选择性和敏感性的新型功能纳米传感材料。选用的肝癌标志物包括：甲胎蛋白（AFP）、谷氨酰转移酶同工酶（GGT-）、-L-岩藻糖甘酶(AFU)、癌胚抗原（CEA）、糖链抗原19-9 (CA19-9)、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素12（IL-12）、干扰素-（IFN-）、胰岛素样生长因子-（IGF-）、肿瘤坏死因子(TNF-)、白细胞介素6（I

10、L-6）、趋化因子15（CCL15）、白细胞介素8（IL-8）3 功能纳米传感材料的性能研究：根据肝癌血清学早期诊断及课题二中微纳器件对功能纳米传感材料的要求，考察纳米材料界面效应对检测对象的扩散、富集及表面反应等的影响，探讨有效提高微反应速率的方法，实现功能纳米传感材料的按需设计与构筑。（3）功能纳米造影材料的设计、构筑与性能研究 纳米造影材料的制备与表征：采用高温有机相热解法或共沉淀法等方法制备超顺磁氧化铁纳米粒子(SPIO)，并对其形态结构及理化性质进行表征；选择纳米凝胶作为SPIO的负载体系，系统研究不同纳米凝胶体系对SPIO的结构、粒径、分散性、超顺磁性以及弛豫率等性质的影响。设计一

11、种直径约200nm的内含高分子惰性气体的包膜微气泡，研究其相应的制备方法，同时为了提高纳米级微泡其稳定性及存活时间，进行其包膜材料的表面改性，成为稳定性高、存活时间长、均一性好的纳米级微泡。采用溶胶-凝胶法、水热法等方法控制合成量子点；对其形态结构及理化性能进行分析；系统研究不同制备体系对量子点的结构、表面状态以及光学、磁学等性质的影响。 生物活性组分与纳米造影材料的耦合：采用吸附、共价键合、交联固定等技术将能与肝癌标志物特异性结合的抗体或配基等生物活性组分耦合于上述纳米造影材料表面；通过体外细胞试验(肿瘤细胞摄取及亲和力检测)考察耦合生物活性组分的纳米造影材料对肝癌细胞的靶向性及其体外成像效

12、果，开发对肝癌细胞具有高度靶向性的新型功能纳米造影材料。选用肝癌细胞表面受体标志物包括：硫酸肝素蛋白多糖3（GPC3）、HAb18G、肝细胞抗原（Hep Par 1)、抗原p230。 功能纳米造影材料的性能研究：采用电子能谱学、光学以及声波学等检测方法，跟踪和分析功能纳米造影材料在动物体内的分布状况及其在肝癌部位的富集过程，探索有效改进肿瘤成像质量、降低最小肿瘤检出尺寸以及提高肿瘤检出率的方法，实现功能纳米造影材料对肝癌准确、灵敏的早期诊断。2.2 肝癌血清学早期筛查的纳米传感微纳器件研究致力于研究基于微纳谐振子、微流控系统和集PCR、电泳、荧光标定于一体的微型全分析系统的生化传感器，研究将这

13、些传感器用于检测肝癌标志物所涉及的关键科学和技术问题，构建便携式实时诊断平台，为新型生化传感器在肝癌早诊中的应用奠定坚实基础。（1） 基于新型谐振子的微纳生化传感器的设计与构建1 新型微纳谐振子结构设计。根据器件性能要求，选择所用结构材料，设计新型微纳谐振子结构，通过在谐振子中设计局域敏感结构，或通过对比阵列结构中不同谐振子的吸附响应，分离吸附引起的弹性常数和质量的变化，提高测量准确性。高灵敏度要求谐振子具有高谐振频率和高品质因子，而基于谐振子的生化传感器将工作在大气环境中，因此需要选择对空气阻尼不敏感的谐振子结构。对肝癌多种标志物的同时检测需要阵列式、集成化敏感结构。探索适用于便携式传感器的

14、新型自驱动方式和高保真自拾振原理。采用有限元方法理论模拟谐振子的静电、压电、机械等多场分布情况，预测其动态响应，确定几何尺寸。2 谐振子和微流控结构的制作。谐振子和微流控结构微纳加工技术应与IC工艺兼容，所需要的实验手段包括：掩模板设计平台、双面光刻、反应离子刻蚀和湿法刻蚀、热氧化、SiO2和SiNx薄膜的PECVD沉积与刻蚀、金属沉积与蒸发、LPCVD生长Poly-Si薄膜和SiNx薄膜，离子注入，低温键合技术，谐振子表面修饰实验装置和环境可控的手套箱系统。通过可靠的高精度微纳加工工艺研究，高质量制备新型谐振子。3 微纳生化传感器的制作。针对不同肝癌标志物及其相应的抗体，用化学方法对谐振子表

15、面进行化学处理、表面改性和抗体的修饰。通过将血清中多种肝癌标志物（如AFP、CCL15、DCP、GPC3和TGF-1等）的抗体平行修饰到谐振子阵列上，实现对多种肝癌标志物进行联合检测，降低假阴性和假阳性。研制微流控芯片及微喷墨打印装置，实现对谐振子阵列的高通量表面修饰。利用纳米表征技术对修饰层进行表征，首先用红外、拉曼、紫外可见吸收等对表面敏感层进行初步表征，确认相关分子中官能团之间进行了设计的交联反应。进一步用生物分析化学方法，对敏感层中具有生物活性的肝癌标志物识别分子进行定量分析。研究敏感材料的微观结构及其与谐振子表面相互作用机理、敏感材料及谐振子的表面/界面效应，研究敏感材料在谐振子表面

16、固定化过程中分子的分布规律及其重复性和稳定性，认识敏感材料在谐振子表面的吸附行为对传感器灵敏度、稳定性和选择性的影响。4 微纳谐振子和生化传感器的表征。所需要的实验手段包括：测试电路设计研制所需的软硬件平台，用于频谱特性测试的网络分析仪、信号发生器和激光多普勒测试系统，用于能量损失机理研究的高真空和超高真空系统。通过电学和光学方法对谐振子的频谱特性进行测试和自检测测量，对生化传感器的特异性吸附响应进行测试。掌握敏感单元间的信号的相互干扰因素和噪声消除以及高精度、低噪声信号采集等关键技术。研究具有不同敏感层的生化传感器与血清中肝癌标志物的相互作用机制及反应动力学，研究传感器的灵敏度、选择性及稳定

17、性。根据血清中不同肝癌标志物的诊断界值，例如，AFP为20 ng/mL、CCL15为16 ng/mL等，进一步优化传感器的设计和加工，实现传感器对不同肝癌标志物的高灵敏度检测。5 微纳生化传感器的系统级封装。基于谐振子的微纳生化传感器对工作环境很敏感，选择适用于微纳生化传感器的低成本、高质量封装方法，即圆片级封装技术，包括低温键合和包封技术，不仅要很好保护谐振子不受环境影响，而且允许谐振子与待测物作用。完成传感器、微流控结构和测试电路的集成，通过光电互联和系统集成，完成便携式器件的制作。所涉及的封装材料包括玻璃、硅和金属等。拟采用的低温键合技术包括以无铅焊料和聚合物为中间层的键合技术，可在10

18、0 C左右的低温，实现键合强度达15 MPa。（2） 微流控器件的设计与构建根据所确定的肝癌标志物以及该标志物的检出方法，通过和项目组内课题一及课题四的密切配合，设计微流控芯片上血样处理流程，实现血浆和血细胞分离、血浆中肝癌标志物的检测、循环肿瘤细胞的捕获和识别等功能，以微流控芯片实验室为平台，对肝癌进行早期诊断。1 微流芯片制作方法。芯片主体结构采用PDMS-玻璃，以模塑法制作，具体步骤如下：a) 模具制作，以硅片为基底，模具的制作包括绘制版图制作掩模光刻三个主要步骤。b) PDMS基片的制作，Sylgard 184硅橡胶弹性体和Sylgard 184固化剂以质量比10 ：1的比例混合，搅拌

19、均匀，在真空干燥箱中脱气，倾倒在硅模具表面，在真空干燥箱中以80 C烘烤1小时，取出，冷却，剥离。c) 键合封装，设计微流控进口和出口，将PDMS基片和玻璃片切成芯片单元。以氧气等离子体方法键合。芯片制作完毕。2 血浆检验部分。基于微流控免疫反应完成多种肿瘤标志物的检测。已初步选择了AFP、CCL15、DCP、GPC3和TGF-1五种标志物，先在微流控芯片上进行单一标志物检测，再进行标志物的组合与筛选。微流控芯片上的免疫反应区预先由抗体包被，在基底上形成抗体带，血浆以垂直方向，在十字交叉点与抗体接触，进行抗原抗体反应，随后通入带有标记物的抗体进行检测。3 血细胞检验部分。由于红细胞比其他细胞体

20、积小得多，利用微柱阵列过滤法去除红细胞；从另一方向用缓冲溶液冲刷被梳状阵列阻挡的细胞，流过包被了上皮细胞粘附分子（EpCam）抗体的微柱阵列，CTCs将被微柱捕获，通入荧光染料对捕获的细胞进行标记和识别。4 构建基于微流控芯片的进样和检测系统，构成一个小型化、便携式的诊断仪器。研究小型进样装置，将外周血注入芯片内部，以微流控芯片实验室为核心检验平台，血液流经芯片上的样品分离区、免疫反应区、细胞捕获区，分别进行血浆和细胞中与肝癌诊断有关的检验分析，从而在一块微流控芯片上、在一个小型仪器中，完成多指标的综合诊断。（3） 集PCR，电泳，荧光标定一体的微型全分析系统1 建立集成式连续流PCR芯片的有

21、限元模型，完成流体布局，实现芯片的集成薄膜加热器、温度传感器、微混合器、微泵、微阀的设计；采用SU-8、PDMS工艺、紫外光照射、等离子键合，实现PCR芯片的表面修饰，采用合适的材料，完成微加热器和传感器、掩模版的设计制造；利用加热模块、帕尔贴等技术实现高效温度控制系统硬件系统，完成微全分析系统的降温模块、信号放大模块、多功能卡信息处理模块等，采用Labview等软件系统实现系统的温度控制。2 将PCR芯片与电泳芯片集成，实现PCR和电泳在同一块芯片上同时完成，通过电泳技术将PCR扩增的肝癌特征物质进行分离，便于进一步进行荧光标定和表征。3 根据设计的肝癌相关基因探针序列，采用DNA合成仪制备

22、肝癌相关寡核苷酸探针；利用抗体筛选技术平台，制备具有生物活性功能的肝癌相关抗体；采用水解法等技术制备抗体Fab片段；制备相应抗体Fab片段，最终筛选出合适的探针。4 利用高温溶剂前驱体分解法合成磁性纳米粒子，采用低温法合成量子点，利用等离子镀膜技术，可控地把磁性纳米粒子与量子点组装在一起，然后在表面包裹上二氧化硅，设计实验并制备出不同粒径的荧光磁性纳米粒子，研究温度、溶剂、反应条件等对最终产物的影响，对产物进行表征。2.3 肝癌影像学早期诊断靶向纳米对比剂的生物特性及其成像技术（1）基于US诊断的肝癌靶向纳米对比剂的研制 肝癌靶向超声纳米对比剂的制备与表征：采用声空化法、高剪切分散法、膜乳化法

23、等方法制备直径200-600 nm、内含高分子惰性气体的纳米气泡，对其包膜材料进行表面改性，使其与靶向分子高效偶联，获得稳定、均一的肝癌靶向超声纳米对比剂；通过TEM、DLS、XRD、AFM等对其形貌和结构进行表征；2 肝癌靶向超声纳米对比剂与细胞相互作用的研究：将不同浓度的超声纳米对比剂与血管内皮细胞、正常肝细胞和肝肿瘤细胞分别作用不同时间，采用荧光标记技术研究纳米对比剂的肝肿瘤细胞靶向性；采用MTT、流式细胞计数等方法检测其细胞毒性；通过离体动物肝脏灌流实验，获取动物离体肝脏组织在正常与病理状态下的组织切片，观察在不同条件下，靶向超声纳米对比剂对不同细胞的损伤方式和聚集黏附作用的效果，结合

24、离体实时图像探索超声纳米对比剂导致血管内皮细胞、肝细胞和肝肿瘤细胞的毒性损伤方式；3 肝癌靶向超声纳米对比剂的声学特性研究：以实验动物离体和在体肝脏为研究对象，灌注靶向超声纳米对比剂，采用不同类型的超声探头，向离体和在体肝发射不同特性参数组合的超声波，接收超声回波信号，分别在时域和频域中对RF原始信号进行数据分析，研究对靶向超声纳米对比剂具有特异性和敏感性的US成像模式；4 肝癌靶向超声纳米对比剂图像重建方法研究：以上一步中确定的超声特性参数为研究对象，分析使肝癌靶向超声纳米对比剂产生特异性和敏感性的物理和生物机理，分离超声RF回波信号中基波和谐波部分，分别提取适用于图像重建的特征信息，重建对

25、早期肝癌具有敏感性的超声基波和/或二次谐波图像；5 肝癌靶向超声纳米对比剂图像特征提取与数据挖掘：对于超声动态图像，首先对序列图像进行配准，消除组织运动干扰，然后建立时间强度曲线（TIC），并提取动脉期、门脉期曲线，最后合成参数化功能超声图像；对于超声静态图像，首先分割靶向超声纳米对比剂增强的组织部位，然后提取反映肝脏病变组织部位形态、分布程度、回声衰减等信息的图像特征，最后根据特征，对病变类型进行判别。（2）基于MRI诊断的肝癌靶向纳米对比剂的研制 肝癌靶向MRI纳米对比剂的制备与表征：采用高温有机相热解法、共沉淀法等方法制备具有超顺磁性的氧化铁纳米粒，选用PAMAM树状大分子等不同材料包裹

26、，利用其表面活性基团与靶向分子偶联，获得具有超顺磁性的新型肝癌靶向磁共振纳米对比剂；选择PEG修饰的不同代数PAMAM树状大分子作为载负材料，共价偶联二乙胺四乙酸螯合钆离子，与靶向分子结合后，获得顺磁性新型肝癌靶向MRI纳米对比剂；通过DLS、TEM、FTIR、VSM、XRD、原子吸收等对纳米对比剂的形貌和结构进行表征；2 肝癌靶向MRI纳米对比剂的体外成像效果评价：培养正常肝细胞和肝肿瘤细胞，考察对比剂对正常肝细胞和肝肿瘤细胞增殖的影响，研究其细胞毒性；采用Scatchard和流式细胞计数分析法对肝癌靶向MRI纳米对比剂进行与肝肿瘤细胞亲和力测定分析，并通过MRI测定信号强度的变化判断对比剂

27、与肝肿瘤细胞的结合程度；检测对比剂的体外磁化特性； 3 肝癌靶向MRI纳米对比剂的体内成像效果评价：常规MRI平扫（T1WI+T2WI）荷瘤动物后，经静脉注入对比剂，行T2WI扫描，确定对比剂经外周静脉注入的安全有效剂量，比较不同磁共振对比剂对肝癌的检出率（数目、直径）；动态增强研究靶向对比剂在T1和T2成像的信号强度与血流灌注的关系，确定肝细胞癌检查窗口时间（扫描启动时间、持续时间、间隔时间）；研究两类成像对比剂有无协同性，先后注入的顺序和间隔时间对T1及T2成像的影响，确定最佳扫描方案（先后注入的顺序和间隔时间）；探索对比剂在肝癌组织聚集后所产生的新的磁学特性，根据其磁学特性研究新的成像原

28、理，寻找磁共振成像的重建方法。 （3）肝癌靶向纳米对比剂的体内过程研究通过静脉注射，将肝癌靶向纳米对比剂注入模型动物体内，采集不同时间点的血样、淋巴液、胆汁、排泄物等，液相色谱串联质谱测定样品中对比剂的浓度，研究对比剂在体内的吸收、分布、代谢、清除行为，获得肝癌靶向纳米对比剂在体内的药物代谢动力学曲线及相关参数；测定动物心、肝、脾、肺、肾、脑六个主要器官中对比剂的浓度，揭示其在体内的分布规律。（4）肝癌靶向纳米对比剂的安全性评价 急性毒性试验：通过静脉注射的方式，将对比剂一次或24h内多次给予受试动物，观察动物死亡情况，以及按毒理指导原则规定的一般观察与指征要求进行部分或全面的观察。2 长期毒

29、性试验：对选择的动物进行分组和给药，然后进行观察。观察项目包括一般检查、实验室检查和病理学检查。一般检查包括行为活动、外观体征、摄食量与摄水量、体重、死亡情况、粪便情况、给药局部反应等。实验室检查包括血液学、血液生化学、尿液分析和粪便检查。病理学检查包括病理剖检和病理组织学检查。 遗传毒性试验：包括基因突变试验、染色体畸变试验和啮齿动物微核试验。 生殖毒性试验：对检查受试动物进行一般生殖毒性、致畸试验和围产期毒性试验。 局部毒性试验：包括局部单次以及反复给药的毒性试验、局部刺激性试验，溶血性试验等。 免疫原性试验：主要包括皮肤过敏试验和全身过敏试验。2.4 纳米技术用于肝癌早期诊断的医学验证（

30、1）血清学检测标志物及微纳器件的医学验证 耦合血清肿瘤标志物的微流控芯片的医学验证：应用构建完成的耦合多种血清肿瘤标志物及细胞因子的微流控芯片检测课题一中筛选验证肝癌血清学标志物实验中同一组患者的血液（取血样时预留一半标本冻存），将芯片检测的标志物的数据与课题一中用常规化验方法检测的数据做对照分析，以证实微流控芯片有更优于目前常规方法的灵敏度和准确性。结合数据分析软件，可实现只用很少的血样（可能只需要一滴血）就可以通过微流控芯片检测出多种标志物、细胞因子的表达水平，根据某几项指标超过预设值来早期筛查肝癌，以实现“实时、高灵敏度、高特异性、高通量”的检测目标。 耦合肝癌细胞表面标志物的微纳器件检

31、测循环肿瘤细胞的医学验证：将微量肝癌HepG2细胞与外周血单个核细胞悬液混匀，通过标记有肝癌细胞表面标志物特异性抗体的纳米微流器件分离，检测纳米微流器件的敏感性和特异性，并计算癌细胞的回收率；采集肝癌患者50例、肝炎和肝硬化患者20例、转移性肝癌患者20例血样，及20个健康志愿者的血样作为阴性对照。用Ficoll密度梯度离心与纳米微流器件首先对患者的外周血进行癌细胞的富集，然后运用FITC-CK标记富集癌细胞，免疫细胞荧光技术对循环肿瘤细胞行形态学分析，进一步验证纳米微流器件的敏感性和特异性；对富集分离出来的循环肿瘤细胞进行培养，通过测定生长曲线和细胞倍增时间，锚着独立性试验了解克隆集落能力，

32、扫描电镜观察细胞表面超微结构，以及裸鼠移植及成瘤观察等方法研究其细胞生物学特性。（2）新型造影材料及技术的医学验证.纳米造影材料的体外验证1 肝细胞癌纳米材料的抗体特性体外验证a. 肝癌细胞株或人体原发性肝细胞肝癌组织样本匀浆分别与肝癌细胞表面抗原（GPC3、HAb18G、HepPar1、p230）的抗体结合，用免疫组化方法证实肝癌细胞株或人体原发性肝细胞肝癌含有上述抗原。b. 靶向磁共振对比剂分别与上述肝癌细胞表面抗原结合，用免疫组化方法证实靶向磁共振对比剂含有上述抗原的抗体，且具有生物活性。c. 肝癌细胞株或人体原发性肝细胞肝癌组织样本匀浆分别与靶向磁共振对比剂共同孵育，进行体外磁共振成像，再用免疫组化方法证实靶向磁共振对比剂能与肝癌细胞特异性结合。2 肝细胞癌纳米材料的细胞毒性评价将肝细胞癌纳米材料与正常肝细胞和肝肿瘤细胞共同培养，考察其对正常肝细胞和肝肿瘤细胞增殖的影响，研究其细胞毒性。3 肝细胞癌