第一章蛋白质化学.docx

1、第一章蛋白质化学第一章 蛋白质化学第一节 蛋白质的分子组成一、蛋白质的基本单位-氨基酸1.蛋白质的元素组成通过元素分析结果证明，所有的蛋白质分子都含有碳、氢、氧、氮、硫等元素，有的蛋白质还含有磷、硒或其他金属元素。蛋白质的氮元素含量较为稳定，多种蛋白质的平均含氮量约为16，因此，测定生物样品中的蛋白质含量时，可以用测定生物样品中氮元素含量的方法间接求得蛋白质的大致含量。每克样品中含氮克数6.25100=100克样品中的蛋白质含量2.氨基酸的结构特点蛋白质彻底水解后，用化学分析方法证明其基本组成单位是-氨基酸。存在于自然界的氨基酸有300余种，但构成天然蛋白质的氨基酸仅有20种，除甘氨酸外，蛋白

2、质中的氨基酸均属L-氨基酸。图1-1-1由图1-1-1可见，连在-COO-上的碳原子是-碳原子(C)，所有20种氨基酸在-碳原子上还带有氨基(NH3+)和氢原子(H)，不同的氨基酸其侧链(R)各异。20种天然氨基酸按侧链的理化性质分为四组： (1) 酸性氨基酸（亲水性侧链氨基酸）：侧链带有-COOH，可电离为-COO-而释放H+； (2) 碱性氨基酸（亲水性侧链氨基酸）：侧链带有-NH2、=NH等碱性基团，可结合H+而形成-NH3+、=NH2+； (3) 不带电荷极性氨基酸（亲水性侧链氨基酸）：侧链不能电离，但侧链含有-OH、-CO-NH2等极性基团，可与水形成氢键； (4) 非极性疏水性氨基

3、酸：侧链均为非极性基团，不能电离，不能与水形成氢键，因此这些侧链都是疏水的。20种天然氨基酸中有两种为特殊氨基酸，它们是脯氨酸与半胱氨酸。脯氨酸属亚氨基酸，但此亚氨基酸仍能与另一羧基形成肽键，不过N在环中，移动的自由度受到限制，当它处于多肽链中时，往往使肽链的走向形成折角。两分子的半胱氨酸脱氢后以二硫键结合成胱氨酸，在蛋白质分子中两个临近的半胱氨酸亦可脱氢形成二硫键（-S-S-）：Cys-SH + HS-Cys Cys-S-S-Cys二、氨基酸在蛋白质分子中的连接方式1肽键1)肽键的形成 蛋白质分子中的氨基酸之间是通过肽键相连的，个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合，即形成肽键(酰胺

4、键，图1-1-2)。2)肽键的特点:部分双键的性质：C-N键不能旋转 3)几个概念 肽平面：由于肽键具有部分双键性质，不能自由旋转所以连接在肽键两端的基团处于一个平面上，这个平面称为肽平面-蛋白质构象的基本单元。肽单元：参与肽键的6个原子被约束于一个平面上，与此相应的-C-CO-NH-C-则称为肽单元 多肽主链：在多肽链中由肽键连接的各氨基酸残基形成的长链骨架(C-CO-NH-C.)为多肽链的主链。或：肽链的骨干是由肽单元重复排列而成长链，称为主链 多肽侧链：在多肽链中的各氨基酸残基所连接的侧链基团为多肽侧链。（说明）：各种不同的肽链主链都是一样的，但侧链（R-基）的顺序即氨基酸的顺序各不相同

5、 加水分解 脱水缩合图1-1-2 肽与肽键2肽与多肽链氨基酸通过肽键(-CO-NH-)相连而形成的化合物称为肽。由两个氨基酸缩合成的肽称为二肽，三个氨基酸缩合成三肽，以此类推。一般由十个以下的氨基酸缩合成的肽统称为寡肽，由十个以上氨基酸形成的肽被称为多肽或多肽链。氨基酸在形成肽链后，氨基酸的部分基团已参加肽键的形成，已经不是完整的氨基酸，称为氨基酸残基。肽键连接各氨基酸残基形成肽链的长链骨架，即C-CO-NH-C结构称为多肽主链。各氨基酸侧链基团称为多肽侧链。每个肽分子都有一个游离的-NH2末端(称氨基末端或N端)和一个游离-COOH末端(称羧基末端或C端)。每条多肽链中氨基酸顺序编号从N端开

6、始。书写某多肽的简式时，般将N端书写在左侧端。第二节 蛋白质的分子结构一、蛋白质分子的一级结构多肽链是蛋白质分子的最基本结构形式。氨基酸排列顺序是由遗传信息决定的，氨基酸的排列顺序是决定蛋白质空间结构的基础，而蛋白质的空间结构则是实现其生物学功能的基础。1953年，英国生物化学家Fred Sanger报道了胰岛素的一级结构，这是世界上第一个被确定一级结构的蛋白质(图2-1-1)。同年，Watson与Crick发现DNA的双螺旋结构。生物化学由此迈向了一个更高层次分子生物学时代。图2-1-1 人胰岛素的一级结构蛋白质多肽链中氨基酸按一定排列顺序以肽键相连形成蛋白质的一级结构。蛋白质的一级结构是其

7、高级结构的基础。蛋白质分子中的多肽链经折叠盘曲而具有一定的构象称为蛋白质的高级结构。高级结构又可分为二级、三级和四级结构。维持蛋白质高级结构的化学键主要是次级键，有氢键、离子键、疏水键、二硫键以及范德华引力。二、蛋白质分子的空间结构蛋白质分子井非如一级结构那样是完全展开的“线状”，而是处于更高级的水平。天然蛋白质可折叠、盘曲成定的空间结构(三维结构)。蛋白质的空间结构指蛋白质分子内各原子围绕某些共价键的旋转而形成的各种空间排布及相互关系，这种空间结构称为构象。按不同层次，蛋白质的高级结构可分为二，三和四级结构。1蛋白质的二级结构多肽链主链中各原子在各局部的空间排布，即多肽链主链构象称为蛋白质的

8、二级结构。(1)形成二级结构的基础肽键平面：20世纪30年代末，Pauling L和Corey R开始对肽进行x线结晶衍射图研究，以探索蛋白质的精细结构。他们测定了分子中各原子间的标准键长和键角，发现肽单元(主链的-CCN-)呈刚性平面（刚度是指物体发生单位形变时所需要的力的大小;刚度越大的物体,其越不容易发生变形;柔度越大的物体越容易发生变形），即肽键平面(图2-1-2)。图2-1-2 肽键平面示意图由于C-N键具有部分双键性质，因此CO和CN均不能自由旋转。(2)蛋白质二级结构的基本形式：蛋白质的肽链局部盘曲、折叠的主要有-螺旋、-折叠、-转角和不规则卷曲等几种形式。1) -螺旋：肽链的某

9、段局部盘曲成螺旋形结构，称为-螺旋。-螺旋的特征是：般为右手螺旋；每螺旋圈包含3.6个氨基酸残基，每个残基跨距为0.15nm，螺旋上升1圈的距离(螺距)为3.60.15=0.54nm；螺旋圈之间通过肽键上的CO和-NH-间形成氢键以保持螺旋结构的稳定；影响-螺旋形成的主要因素是氨基酸侧链的大小、形状及所带电荷等性质。2)-折叠：为种比较伸展、呈锯齿状的肽链结构。两段以上的-折叠结构平行排布并以氢键相连所形成的结构称为-片层或-折叠层。-片层可分顺向平行(肽链的走向相同，即N、C端的方向一致)和逆向平行(两肽段走向相反)结构。图2-1-3 左图-螺旋 右图-片层3) -转角：此种结构指多肽链中出

10、现的一种180的转折。-转角通常由4个氨基酸残基构成，由第1个残基的CO与第4个残基的-NH-形成氢键，以维持转折结构的稳定。4)不规则卷曲：此种结构为多肽链中除以上几种比较规则的构象外，多肽链中其余规则性不强的些区段的构象 。各种蛋白质依其一级结构特点在其多肽链的不同区段可形成不同的二级结构。如蜘蛛网丝蛋白中有很多-螺旋及-折叠层，也有-转角和不规则卷曲。三、蛋白质的三级结构多肽链中，各个二级结构的空间排布方式及有关侧链基团之间的相互作用关系，称为蛋白质的三级结构。换言之，蛋白质的三级结构系指每一条多肽链内所有原子的空间排布，即多肽链的三级结构=主链构象+侧链构象，三级结构是在二级结构的基础

11、上由侧链相互作用形成的。多肽链的侧链（也就是氨基酸的侧链）分为亲水性的极性侧链和疏水性的非极性侧链（详见氨基酸分类）。水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把多肽链的疏水性侧链或疏水性基团埋藏在分子的内部。这一现象被称之为疏水作用或疏水效应。疏水作用的本质是疏水基团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫相互靠近，并不是疏水基团之间有什么吸引力的缘故，因此，将疏水作用称之为“疏水键”是不正确的。疏水作用是维系蛋白质三级结构最主要的动力。除疏水作用外，维系蛋白质的三级结构的动力还有氢键、盐键（离子键）、范德华力和二硫键等。三级结构对于蛋白质的分子形状及其功能活性部位的形成起重要作用，通过三级结构的形成，可将

12、肽链中某些局部的几个二级结构汇成“口袋”或“洞穴”状，这种结构称为结构域，它们的核心部分多为疏水氨基酸构成，结合蛋白质的辅基常镶嵌在其中，这种结构域多半是蛋白质的活性部位。有的蛋白质分子中只有一个特异的结构域，有的则有多个结构域。最近，在很多蛋白质分子中发现有两段-折叠之间通过一段-螺旋相连而形成的球状结构，以及多个-螺旋形成的螺旋束，或三个二硫键将肽链连接成的三环状结构等结构域与功能活性有密切关系。四、蛋白质的四级结构有的蛋白质分子由两条以上具有独立三级结构的肽链通过非共价键相连聚合而成，其中每一条肽链称为一个亚基或亚单位。各亚基在蛋白质分子内的空间排布及相互接触称为蛋白质的四级结构。具有四

13、级结构的蛋白质，其几个亚基的结构可以相同，也可以不同。如红细胞内的血红蛋白(Hb)是由4个亚基聚合而成的，4个亚基两两相同，即含两个亚基和两个亚基。在一定条件下，这种蛋白质分子可以解聚成单个亚基，亚基在聚合或解聚时对某些蛋白质具有调节活性的作用。有的蛋白质虽由两条以上肽链构成，但几条肽链之间是通过共价键(如二硫键)连接的，这种结构不属于四级结构，如前面提到过的胰岛素就是1例。第三节蛋白质分子结构与功能的关系一、蛋白质的一级结构与其构象及功能的关系蛋白质一级结构是空间结构的基础，特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R基团形成的次级键来维持，在生物体内，蛋白质的多肽链一旦被合成后，即可根据

14、一级结构的特点自然折叠和盘曲，形成一定的空间构象。一级结构相似的蛋白质，其基本构象及功能也相似，例如，不同种属的生物体分离出来的同一功能的蛋白质，其一级结构只有极少的差别，而且在系统发生上进化位置相距愈近的差异愈小。在蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基，即使在整个分子中发生一个残基的异常，那么该蛋白质的功能也会受到明显的影响。被称之为“分子病”的镰刀状红细胞性贫血仅仅是574个氨基酸残基中，一个氨基酸残基即亚基N端的第6号氨基酸残基发生了变异所造成的，这种变异来源于基因一场信息的突变。 正常红细胞 镰刀状红细胞 二、蛋白质空间构象与功能的关系蛋白质多种多样的

15、功能与各种蛋白质特定的空间构象密切相关，蛋白质的空间构象是其功能活性的基础，构象发生变化，其功能活性也随之改变。蛋白质变性时，由于其空间构象被破坏，故引起功能活性丧失，变性蛋白质在复性后，构象复原，活性即能恢复。在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种现象称为蛋白质的别构效应。蛋白质(或酶)的别构效应，在生物体内普遍存在，这对物质代谢的调节和某些生理功能的变化都是十分重要的。第四节蛋白质的理化性质蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，其理化性质一部分与氨基酸相似，如两性电离、等电点、呈色反应、成盐反应等，也有一部分又不

16、同于氨基酸，如高分子量、胶体性、变性等。一、蛋白质的两性电离蛋白质是由氨基酸组成的，其分子中除两端的游离氨基和羧基外，侧链中尚有一些解离基，如谷氨酸、天门冬氨酸残基中的和-羧基，赖氨酸残基中的-氨基，精氨酸残基的胍基和组氨酸的咪唑基。作为带电颗粒它可以在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带的电荷。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液的pH影响。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质游离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子(净电荷为O)，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(简写pI)。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。蛋白质溶液的pH大

17、于等电点，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。各种蛋白质分子由于所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不同，因而有各自的等电点。凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏碱性，如组蛋白、精蛋白等。反之，凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏酸性，人体体液中许多蛋白质的等电点在pH5.0左右，所以在体液中以负离子形式存在。二、蛋白质的胶体性质蛋白质分子量颇大，介于一万到百万之间，故其分子的大小已达到胶粒1100nm范围之内。球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈地吸引水分子作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围，称水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集。与低分子物质比较，蛋白质分子扩散速度慢，不易

18、透过半透膜，粘度大，在分离提纯蛋白质过程中，我们可利用蛋白质的这一性质，将混有小分子杂质的蛋白质溶液放于半透膜制成的囊内，置于流动水或适宜的缓冲液中，小分子杂质皆易从囊中透出，保留了比较纯化的囊内蛋白质，这种方法称为透析。三、蛋白质的沉淀蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀，变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。 蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。若无外加条件，不致互相凝集。然而除掉这两个稳定因素(如调节溶液pH至等电点和加入脱水剂)蛋白质便容易凝集析出。如将蛋白质溶液pH调节到等电点，蛋白质

19、分子呈等电状态，虽然分子间同性电荷相互排斥作用消失了。但是还有水化膜起保护作用，一般不致于发生凝聚作用，如果这时再加入某种脱水剂，除去蛋白质分子的水化膜，则蛋白质分子就会互相凝聚而析出沉淀；反之，若先使蛋白质脱水，然后再调节pH到等电点，也同样可使蛋白质沉淀析出。引起蛋白质沉淀的主要方法有下述几种： 1. 盐析在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来

20、，盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。 2. 有机溶剂沉淀蛋白质 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。3. 生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 蛋白质又可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷易于与酸根负

21、离子结合成盐。临床血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。4. 重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀，沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。因为此时蛋白质分子有较多的负离子易与重金属离子结合成盐。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。 临床上利用蛋白质能与重金属盐结合的这种性质，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。5. 加热凝固 将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固而沉淀。加热首先是加

22、热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。 四、蛋白质的变性天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下，其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性称之为蛋白质的变性作用。变性蛋白质只有空间构象的破坏，一般认为蛋白质变性本质是次级键，二硫键的破坏，并不涉及一级结构的变化。变性蛋白质和天然蛋白质最明显的区别是溶解度降低，同时蛋白质的粘度增加，结晶性破坏，生物学活性丧失，易被蛋白酶分解。引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两类。物理

23、因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在临床医学上，变性因素常被应用于消毒及灭菌。反之，注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂。变性并非是不可逆的变化，当变性程度较轻时，如去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性。许多蛋白质变性时被破坏严重，不能恢复，称为不可逆性变性。蛋白质的变性、沉淀，凝固相互之间有很密切的关系。但蛋白质变性后并不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近才沉淀，沉淀的变性蛋白质也不一定凝固。例如，蛋白质被强酸、强碱变性后由于蛋白质颗粒带着

24、大量电荷，故仍溶于强酸或强减之中。但若将强碱和强酸溶液的pH调节到等电点，则变性蛋白质凝集成絮状沉淀物，若将此絮状物加热，则分子间相互盘缠而变成较为坚固的凝块。五、蛋白质的吸收光谱及几种重要的呈色反应（一）蛋白质的吸收光谱色氨酸、酪氨酸在280nm波长附近具有最大的光吸收峰，由于大多数蛋白质含有色氨酸和酪氨酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值常用于蛋白质含量的测定。（二）蛋白质的呈色反应1. 茚三酮反应氨基酸与水化茚三酮(苯丙环三酮戊烃)作用时，产生蓝色反应。2. 双缩脲反应蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称双缩脲反应。凡分子中含有两个以上CONH键的化合物都呈此反应，蛋白质分子中氨基酸是以肽键相连，因此，所有蛋白质都能与双缩脲试剂发生反应。 此外，蛋白质溶液还可与酚试剂、乙醛酸试剂、浓硝酸等发生颜色反应。