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1、毕业论文新疆乳酸菌分离分析解析新疆传统乳制品中乳酸菌的分离及胆盐耐受性研究摘要 从新疆少数民族地区克孜勒苏柯尔克孜自治州阿合奇县、伊犁哈萨克自治州那拉提草原及新源县城、哈密地区巴里坤草原的酸奶、奶疙瘩、马奶酒中分离得到110株乳酸菌,将其中25株乳酸菌在小肠模拟液中进行乳酸菌胆盐耐受性研究，旨在筛选出耐受胆盐的优良乳酸菌株。通过配制0.3%（w/v）胆盐浓度的磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=8.0）模拟人体肠道高胆盐环境，将待测乳酸菌株置于其中，分别于第0h、4h采用倾注平板法测定活菌数，通过比较活菌数大小，筛选出耐受胆盐的乳酸菌株，并对其进行16S rDNA V3可变区PCR扩增，对PCR产物

2、进行序列分析，确定其属种。试验表明，编号为1.7、1.8、3.2、4.2、4.5、5.7、6.3的菌株对胆盐耐受能力较强。经鉴定其中六株菌为植物乳杆菌菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum），一株菌为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）。关键字 乳酸菌；分离；筛选；小肠模拟液；胆盐耐受性The Study of Bile Resistence of Lactic Acid Bacteria Isolated from Fermented Dairy Food in XinjiangAbstract：From the Xinj

3、iang minority areas Kezilesu Kirgiz Autonomous Prefecture akqi , county , Ili Kazak Autonomous Prefecture of grassland and Xinyuan County , the Hami region Balikun grassland yogurt , milk knots , Kumiss isolated 110 strains of lactic acid bacteria ,25 lactic acid bacteria bile salt tolerance of lact

4、ic acid bacteria in the small intestine simulation solution , designed to filter out the good tolerance to bile salts of lactic acid bacteria strains .Preparation of 0.3 % ( w / v ) bile salt concentration of phosphate buffer solution ( PBS , pH = 8.0 ) to simulate the human intestinal bile salts en

5、vironment , the strain of lactic acid bacteria to be tested is placed therein , respectively, at # 0h 4h poured plate method and the number of viable cells was measured by comparing the number of viable cells size and filter out the tolerance to bile salts of lactic acid bacteria strains , and its 1

6、6S rDNA V3 variable region PCR amplification , the PCR product was subjected to sequence analysis , to determine their species .The tests showed that the strains numbered 1.7,1.8,3.2,4.2,4.5,5.7,6.3 strong bile tolerance . Identified six strains of Lactobacillus plantarum bacteria plant subspecies ,

7、 a Lactobacillus casei bacteria.Key words：Lactic acid bacteria ; Separation ; Filter;Simulated body fluid of the small intestine ; Bile salt tolerance1 前言 1.1 新疆传统乳制品中乳酸菌的发展史新疆存在着丰富的乳酸菌资源，很多少数民族地区包括克孜勒苏柯尔克孜自治州阿合奇县、伊犁哈萨克自治州那拉提草原及新源县城、哈密地区巴里坤草原等地的牧民仍然沿用传统而古老的方法来制造各种乳制品，包括酸牛乳、酸马奶、奶疙瘩、马奶酒等，从而使当地自然环境中的有益

8、微生物得到了很好的保存。不同来源的制品中蕴藏着不同种类的乳酸菌，这很大程度上取决于制品的制作方法和地域。传统的乳酸菌鉴定方法主要是依据其形态学及生理生化特性进行，近年来采用分子生物学方法对乳酸菌进行鉴定已有较大进展1。目前对传统食品中乳酸菌菌株的鉴定存在的最大问题就是缺乏一种通用的系统或平台来鉴定不同来源的乳酸菌。1.1.1 新疆传统发酵乳制品新疆对乳酸菌的研究，主要是针对马奶酒、奶疙瘩、酸奶等传统乳制品进行的。马奶酒是营养价值很高的具有民族传统特色的高级活性保健饮料，是由乳酸菌和酵母菌对乳糖进行的乳酸发酵及酒精发酵所制成。其中含有多种具有生物活性的营养成分，主要包括蛋白质、人体必需氨基酸、维

9、生素A、硫胺素、维生素C、维生素B2、维生素E等2。民族特色干酪（奶疙瘩）新疆酸凝奶酪，可以说是牛奶的结晶体，其做法大都是靠手工，做法有2种。一种在发酵之前要将奶皮子去掉（脂肪），一种则不用。哈萨克族牧民做奶疙瘩时，先将牛奶灭菌后采用自然环境中的乳酸菌发酵，然后把发酵后的酸奶倒入锅里熬制，最后将其装入布袋中吊起，使其水分滴尽，晾干即成。酸凝奶酪的制作究其原理主要是利用乳酸菌在牛乳中发酵产生乳酸，降低牛乳的pH 值（从6.6降至4.6左右），从而达到酪蛋白的等电点，使酪蛋白凝块，排出乳清，降低了奶酪的水分含量，并且较低的pH还会抑制许多致病菌和其他不利菌的生长，从而获得比牛乳更长的保质期。许多乳

10、酸菌还可以产生胞外多糖，产生一些分解蛋白质的蛋白酶，对干酪的结构功能特性、风味均有十分重要的影响。1.1.2 新疆传统乳制品中乳酸菌的研究近年来，新疆传统乳制品中乳酸菌的研究也有很大进步与贡献。孙天松等3在新疆和蒙古国采集的四份酸驼乳中分离得到的10株乳酸菌，经鉴定10株(77%)为乳杆菌，3株(23%)为乳球菌。新疆的2份样品中只分离到乳杆菌，蒙古的1份样品中仅有乳球菌，另1份样品中既有乳杆菌又有乳球菌。张江巍等4,5 进行了新疆酸马奶抗氧化性能乳酸菌的筛选，筛选出性状优良、具有抗氧化活性的乳酸菌菌株，为开发具有抗氧化活性的功能性食品提供理论依据。通过菌株对H2O2 的耐受能力实验、羟自由基

11、清除实验、还原活性测定实验以及亚铁离子螯合能力测定实验，对28株乳酸菌活细胞体、无细胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力进行测定。该研究筛选出两株益生乳酸菌S3、Y11具有较高的抗氧化能力，两株菌对实验所用的不同浓度过氧化氢具有一定的耐受能力；当添加样品量为1.5mL时，两株菌的活细胞体和无细胞提取物对羟自由基的清除率分别为38.1%和25.2%，52.3%和29.7%；两株菌均具有还原活性，A700nm值分别为2.272和3.083；两株菌对亚铁离子（Fe2+）的螯合率分别为36.62%和43.16%。以上研究说明28株乳酸菌菌株的抗氧化能力存在差异，乳酸菌菌体内可能含有较多的起抗氧化作用的活

12、性物质，并筛选出2株具有较强抗氧化能力的乳酸菌菌株。 1.1.3 新疆乳品加工业发展现状新疆目前有一家生产干酪素的企业，即新源伊品酪蛋白乳业有限公司。该企业主要利用当地农牧民的酸奶、酸奶疙瘩为原料，生产工业用干酪素，出口欧美等国家，年产量约1000t(折合耗用原料奶约3.3万t)，对促进当地奶业发展，提高农牧民经济收入具有积极意义，也为新疆干乳制品生产提供了新的思路。2005 年新疆瑞源乳业有限公司(库尔勒市)和北京巴斯德公司合作，引进一条小型干酪生产线，生产的农家干酪、风味硬质干酪(商品名“铁木真干粮”)等产品已投放市场，受到了消费者的青睐6。2004 年以来，新疆达瓦昆畜牧生物科技有限责任

13、公司(岳普湖县)和新疆医科大学、新疆营养学会、新疆奶业协会的专家们合作研究驴奶的化学成分和营养价值，采用租驴挤奶等方式，较好的解决了驴奶产量低、难以实现规模化生产的矛盾, 建立了国内第1条驴乳粉生产线，制定了驴乳粉企业标准，开发出驴乳粉并投放市场，填补了国内驴乳制品的空白。驴乳粉的生产开发，对充分发挥新疆的驴资源优势，加强驴的综合利用，提高农牧民经济收入，增加乳制品新品种具有积极意义，具有良好的发展前景7。 1.2 乳酸菌的介绍 1.2.1 乳酸菌的定义 乳酸菌(lactic acid bacteria LAB)属于原核类生物中的一类异养厌氧型或兼性厌氧型细菌8，利用可发酵碳水化合物（主要是葡

14、萄糖或乳糖）产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的总称，广泛存在于人和动物的肠道中，能维持机体内多种微生物菌群之间的平衡，与人类的健康息息相关，同时乳酸菌可以改善食品的风味，提高食品的营养价值以及特殊的生理活性，更是极大程度上延长了食品的保鲜时间。 1.2.2 乳酸菌的形态结构及分布 乳酸菌是革兰氏阳性细菌，菌体一般呈细长的杆状、长链状、圆形或卵圆形、分支状、也有四联状。菌体的细胞形态会随着所处环境条件的不同而变化。大多数的乳酸菌不运动，或只有少数借助于周毛进行缓慢移动。乳酸菌是人和动物体肠道内最重要的益生菌群，如嗜酸乳杆菌，它们在肠壁上能抑制致病菌的生长繁殖；同时在垃圾、淤泥和动物的排泄物中也有分布；

15、在食品方面，酸奶中有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等；黄油中有德氏乳杆菌和乳油链球菌。 1.2.3 乳酸菌的分类到目前为止，已经发现的乳酸菌至少有27个属，一共包括300多种。从形态上分，乳酸菌可以分为球状、杆状链状、分支状三大类。如圆形或卵圆形的肠膜明串珠菌、分支状的双歧乳杆菌、四联状的乳酸片球菌。现在国际上普遍采取的是伯杰氏细菌鉴定手册中乳酸细菌的分类方法，而我国凌代文9将乳酸细菌分成四大类：革兰氏阳性无芽孢杆菌、形成内生芽孢的杆菌、革兰氏阳性兼性厌氧球菌、不规则形的专性厌氧菌。 1.2.4 乳酸菌的益生功能科学家们对乳酸菌的益生功能进行了相关研究，主要有：改善肠道功

16、能，维持肠道内各菌群之间的动态平衡；养胃健胃，促进食物的消化与营养物质的吸收；预防高血压，改善血脂代谢的作用；彻底消灭乳糖不耐症；为人体提供钙质来源；预防癌症；提高人体的免疫力；降低血清中胆固醇和脂肪的浓度以及降血压；能显著提高SOD酶活性，延缓衰老；抑制致病菌的生长；产生酸性代谢产物等10。正因为乳酸菌有如此多的保健功能，目前市场上的乳酸菌制品，如酸奶、酸豆奶、乳酸菌口服液、乳酸菌片剂等产品受到广大消费者的青睐。国内各大乳品公司也在开发具有特殊保健功能的乳酸菌株，例如蒙牛公司冠益乳产品中添加的“BB-冠菌（动物双歧杆菌乳亚种）”，伊利公司从丹麦汉森公司所购专利菌株“LGG（鼠李糖乳杆菌）等”

17、，这两株菌均可耐受人体胃环境及小肠环境，能在健康人肠道中定殖，发挥其益生功能。 1.2.5 乳酸菌的发展前景乳酸菌的遗传与育种：在乳制品发酵中，乳酸菌菌种的选择对发酵剂的质量起着重要作用。一方面，可利用转基因技术和遗传技术测定乳酸菌的碱基序列，进而进行基因改良，以得到发酵性能好的乳酸菌菌种。另一方面，亦可从现有的乳制品中分离筛选出具有良好加工特性的菌种，为乳酸菌在各个领域中的研究、运用奠定基础。 重点开发具有预防和保健功能的乳酸菌制品：要功能包括调节血脂、抑制肿瘤、延缓衰老等，这些都与人类的健康有关，对效应本身与作用机制的研究，都有待于今后的发展。乳酸菌行业的发展对人类健康起到了关键性的作用，

18、人们越来越倾向于预防疾病而不再是治疗疾病，通过乳酸菌的制品来防御外界的伤害，强化自身的健康状态，所以乳制品在预防疾病方面成为今后科技攻关的重点和难点。 1.3 乳酸菌在人体中的定殖经多年研究发现, 人体胃肠道中存在着400余种细菌, 它们在人体胃肠道中定殖并进行繁殖, 构成了一个复杂的微生态环境, 对人体具有重要的生理功能11。人体胃液pH值在2左右，其中乳酸菌种类较少，主要为嗜酸乳杆菌，大部分乳酸菌均分布在人体小肠、大肠、结肠中，帮助人体消化食物、分泌有益代谢产物、抑制病原菌繁殖等。乳酸菌作为胃肠道中主要的益生菌之一, 近一个世纪以来, 有很多微生态制剂都以其作为主要活菌成分。其中乳杆菌的保

19、健作用研究的最为广泛与深入，有很多微生态制剂都以其作为主要活菌成分。另一方面, 由于乳杆菌具有公认的安全性, 可将其作为外源蛋白的微生物释放载体。现根据有无外源基因的表达可将微生态制剂分为两类, 一类是直接将未经基因改造的原型活菌运用于人体, 另一类则是通过基因工程对活菌进行改造, 使之表达蛋白后作为活菌制剂运用于人体。但不论哪一类, 都是通过其含有活菌的积极生命活动来达到其目的的, 即这些微生物在人体内的存活能力高低将直接关系到其健康促进作用的发挥12。微生物能否在人体内定殖存活与其耐胆盐能力有关11 ,能够耐受小肠胆盐的乳酸菌，才可能在人体中存活，并定殖，进而大量繁殖，维护肠道正常菌群。

20、1.4 本研究的目的与意义本研究从新疆传统乳制品奶疙瘩、酸奶、马奶酒中分离得到乳酸菌25株，以胆盐浓度为0.3%的磷酸盐缓冲液（PBS）（pH=8.0）模拟正常人体的胆汁盐分泌量, 对其在模拟肠道环境条件下的抗性进行研究, 为该菌株能否顺利通过肠道环境发挥健康促进作用, 提供一定的理论依据。通过测定耐胆盐能力, 初步筛选出具有较强耐胆盐能力的优良菌株,为最终筛选能很好地在人体胃肠道存活定殖的人用乳杆菌奠定一定的基础。2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 样品与菌株来源从克孜勒苏柯尔克孜自治州阿合奇县、伊犁哈萨克自治州那拉提草原及新源县城、哈密地区巴里坤草原采集的酸奶、马奶酒、奶疙瘩中分

21、离出乳酸菌株共计110株。 2.1.2 试剂与仪器 2.1.2.1 试剂本研究所用的主要试剂见表1所示表 1 主要试剂名称生产单位纯级磷酸钾天津市致远化学试剂有限公司RC级葡萄糖上海山浦化工有限公司RC级乙酸钠上海山浦化工有限公司AR级95%乙醇天津市精细化工有限公司AR级氢氧化钠洛阳市化学试剂厂AR级磷酸钾天津市致远化学试剂有限公司RC级葡萄糖上海山浦化工有限公司RC级乙酸钠上海山浦化工有限公司AR级95%乙醇天津市精细化工有限公司AR级氢氧化钠洛阳市化学试剂厂AR级蛋白胨北京奥博星生物技术有限公司RC级名称生产单位纯级酵母浸膏北京奥博星生物技术有限公司RC级 硫酸锰上海山浦化工有限公司RC

22、级 吐温80天津市北联精细化学品开发有限公司CP级 牛胆盐上海山浦化工有限公司RC级MRS琼脂北京奥博星生物技术有限公司RC级 牛肉膏北京奥博星生物技术有限公司BC级 MRS肉汤杭州百思生物技术有限公司 BR 级 2.1.2.2 仪器超净工作台（SW-CJ-1F）、高速台式离心机TGL-16G、不锈钢加热板DB-1、PH/ORP/温度测定仪、101型电热鼓风干燥机、SK3167立式保鲜柜、HP-9162MBE电热恒温培养箱、SK3470立式压力蒸汽灭菌锅、EL204-C分析天平、GL-22LM高速冷冻离心机、50mL、250mL、500mL的锥形瓶、试管、培养皿若干、250mL、50mL的烧杯

23、、接种针、酒精灯、打火机、棉球、纱布、移液管、吸耳球、移液枪、离心管等。 2.1.3 培养基和培养条件 2.1.3.1 培养基前期冻存菌种使用MRS液体培养基进行活化，后期将活化好的乳酸菌菌株离心后放入PBS缓冲溶液中进行胆盐耐受性试验。培养基的配制方法：（1）MRS培养基：蛋白胨10g、磷酸二氢钾2g、柠檬酸二胺2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、硫酸镁结晶0.58g、硫酸锰0.25g、牛肉膏10g、酵母膏10g、吐温80使用1mL，加蒸馏水至1000mL（固体MRS培养基加入15g琼脂粉），调整pH至6.3，121下灭菌15min。 （2）PBS缓冲液的配制：水需要用蒸馏水，配置好的PBS缓冲

24、液要于121下灭菌15min。母液的配制：0.2moL Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O溶于1000mL蒸馏水中。 0.2moL KH2PO4：称取31.2g KH2PO4-2H2O溶于1000mL蒸馏水中。表 2 PBS缓冲液的配制pH0.2moL Na2HPO4（mL）0.2moL KH2PO4（mL）6.568.531.58.05.394.7 （3）模拟小肠液的配制：实验组：PBS缓冲液（pH=8.0）和0.3%胆盐。 对照组：PBS缓冲液（pH=8.0）不加胆盐。 （4）生理盐水的配制：0.9%NaCl：100mL蒸馏水中加入0.9gNaCl。 （5）脱脂乳的

25、配制：脱脂乳粉12g加蒸馏水至100mL，于110灭菌20min13。 2.1.3.2 培养条件（1）MRS固体培养基接种后置于37恒温箱培养48h，MRS液体培养基用于传代培养，接种后置于37恒温箱培养不超过24h。（2）模拟小肠液实验组（PBS缓冲液（pH=8.0）和0.3%胆盐）和对照组（PBS缓冲液（pH=8.0）不加胆盐）中的菌放置于37恒温培养箱4h。 2.2 试验方法 2.2.1 乳酸菌的分离与纯化 （1）对采集的样品用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，取10-3、10-4两个稀释度，各取1mL涂布于MRS固体平板培养基，并标记。每个稀释梯度做两个平行，置于37恒温培养箱中倒置培养

26、48h。（2）将长出的乳酸菌菌落划线接种到MRS固体平板培养基进行进一步纯化。 （3）乳酸菌初步鉴定： 首先观察乳酸菌菌落特征，乳酸菌菌落较小，约13mm，圆形隆起，表面光滑或稍有粗糙，呈乳白色，灰白色或暗黄色。若视觉检测初步判断为乳酸菌，则对其进行革兰氏染色并镜检。乳酸菌菌体呈短、长杆状或链球状。对镜检革兰氏染色为阳性的杆菌或链球菌再进行过氧化氢酶试验，配制5%过氧化氢溶液，滴加到单菌落上，产生气泡为过氧化氢酶阳性，否则为阴性。将革兰氏染色阳性的杆菌、同时过氧化氢酶阴性的菌株初步鉴定为乳酸菌。（4）将初步鉴定为乳酸菌的菌株接入液体MRS培养基培养，传代两到三次，通过显微镜镜检是否为纯菌。（5

27、）将传代后的乳酸菌菌株接入脱脂乳培养基，于37培养凝乳后保存于4冰箱14。若脱脂乳凝乳状态良好，可确定该株菌确为乳酸菌。 2.2.2 乳酸菌菌株的活化初步鉴定为乳酸菌的有110株菌，将其中25株菌进行活化传代。于液体MRS培养基按2%接种量传代，于37培养24h，传代两次，使乳酸菌菌株的活力恢复。 2.3 乳酸菌菌株胆盐耐受性的测定 2.3.1 乳酸菌菌株的离心将活化后的菌株于离心管中离心（5000g 10min 5)，获得菌泥，用PBS缓冲液（pH=7.2）冲洗3次，将冲洗后的菌泥再次离心，共离心3次。同一个菌株需离心2管。 2.3.2 乳酸菌菌株在模拟小肠液中的存活性将获得的菌泥重新悬浮于

28、5mL的模拟小肠液（实验组）中和对照组PBS缓冲液（pH=8.0），置于37恒温培养箱中，分别于第0h、4h取出，按照下述方法测定管内活菌数。第0h：将模拟小肠液菌悬液取0.5mL于4.5mL无菌生理盐水中，依次进行10倍梯度稀释，实验组和对照组都选择第10-7稀释梯度，从中取1mL混悬液于灭菌后的平板，将灭菌后的固体MRS培养基（461，凉至不烫手后）倒入平板，混匀。培养24h或48h后取出，进行活菌计数。（灭菌后的固体MRS培养基放在47培养箱内备用）。第4h：将模拟小肠液中的菌株于37恒温培养箱培养4h，4h后同法进行梯度稀释。实验组选择第10-5稀释梯度，对照组选择第10-7稀释梯度，

29、按照上述倾注平板法进行活菌计数。按照菌落数的结果计算乳酸菌在模拟小肠液和对照组中第0h和4h时的活菌数（CFU/mL）。2.3.2 乳酸菌株的鉴定 取能够耐受胆盐的乳酸菌株若干株，采用酚/氯仿/异戊醇方法提取菌体DNA，以16S rDNA V3可变区引物进行PCR，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳试验，回收电泳产物，送往上海生工生物工程有限公司进行基因测序，测序结果通过在NCBI BLAST对比，根据相似度确定所鉴定菌株的属、种。上游引物：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3下游引物：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3PCR体系10 PCR Reaction Buffe

30、r 2.5 LMg2+ 2.0 LdNTP 1.0 L引物 1.0 LTaqE 0.2 L模板 2.3 LddH2O 16 LPCR条件：95C预变性5 min。95C 35s，55C 35s，72C 90s，35个循环 72C延伸8 min。电泳条件：1%的琼脂糖凝胶，1TAE缓冲液，80V恒压电泳30min。 参考夏涵等15的方法提取大肠杆菌培养物的DNA，略作改动，具体方法如下：（1）取4 mL过夜培养的菌液于10 mL离心管中，于10 000 g离心5 min，弃上清。 （2）向沉淀中加入600 L 1TE缓冲液，用移液器吸头反复吹打沉淀，使之重悬，加入30 L SDS溶液（w/v，1

31、0 %）和3 L蛋白酶K（20 mg/mL），混匀，于70 水浴中静置10 min。（3）加入633 L酚/氯仿/异戊醇，混匀，冰浴5 min，于14 000 g离心5 min，用200 L移液器小心吸取上清至新EP管中。（4）加入等体积酚/氯仿/异戊醇，混匀，冰浴5 min，于14 000 g离心5 min，用200 L移液器小心吸取上清至新EP管中。 （5）加入2倍体积的100 %乙醇，和0.1倍体积的NaAc，冰浴静置10 min，于14 000 g离心5 min。弃上清。 （6）加入500 L预冷的75 %乙醇，于16 000 g离心5 min，弃上清。 （7）重复步骤（6）。 （8）将EP管放于超净工作台上，将风速调至最大，风干。 （9）加入50 L超纯水，用移液器吸头反复吹打混匀，置于20 冰箱备用。3 结果与分析 3.1 乳酸菌株的分离及初步鉴定经形态观察、革兰氏染色镜检及过氧化氢酶试验，共分离得到110株乳酸菌（编号为1.0、1,1、1.2、1.3、1.4、1.6、1.7、1.8、2.0、2.3、3.2、3.5、4.2、4.5、4.6、4.1、4.7、4.8、6.4、5.6、5.7、5.8、6.0、6.2、6.3、3、9、11、12、13、18、19、