席夫碱与牛血清蛋白521教案.docx

1、席夫碱与牛血清蛋白521教案紫外光度法研究-氨基-硝基吡啶水杨醛席夫碱与牛血清蛋白的相互作用化学工程与工艺学生 李伟栋指导老师 庞艳玲摘要：采用紫外分光光度法研究了自制2氨基-5硝基吡啶水杨醛席夫碱试剂与牛血清蛋白（BSA）的相互作用。确定了最佳条件：支持电解质氯化钠的浓度为0.15mol/L，反应时间为50分钟，室温。在此条件下，席夫碱和牛血清蛋白相互作用形成稳定的络合物，络合物最大吸收波长为353nm，与2氨基-5硝基吡啶水杨醛席夫碱试剂的最大吸收波长363nm比较，紫移了10nm，络合比为40:1，摩尔吸光系数是8.7103 Lmol-1cm-1, BSA浓度在3.45400mg/L间具

2、有良好的线性关系, 检出限为1.03mg/L。加标回收率在93.3%100.3%之间。关键词：2-氨基-5硝基吡啶水杨醛席夫碱 牛血清蛋白（BSA） 紫外分光光度法UV spectrophotometric study of 2 - amino -5 - nitropyridine interaction Salicylideneaminio base with bovine serum albuminStudent majoring in Chemical Engineering and Technology Li weidongTutor Pang yanlingAbstract: Stu

3、died using UV spectrophotometry self - made - Amino - 5 - nitropyridine salicylaldehyde Schiff base reagent with bovine serum albumin (BSA) interactions. Determine the optimal conditions were as follows: concentration of the supporting electrolyte is sodium chloride 0.15mol / L, the reaction time wa

4、s 50 minutes at room temperature, 40:1 complex.Under this condition, the Schiff base and bovine serum proteins interact to form a stable complex, the maximum absorption wavelength of 353nm (with a 2 - amino-5 - Compare Nitropyridine salicylaldehyde Schiff base reagent maximum absorption wavelength o

5、f 363 purple shifted 10nm) optimal concentration of BSA is 5.110-6mol / LKey words: 2 - amino-5 - Compare Nitropyridine salicylaldehyde Schiff base reagent bovine serum albumin (BSA) UV spectrophotometry引言 席夫碱是一类非常重要的含氮配体，它是由醛或酮的羰基和伯胺、肼及其衍生物的胺基基团缩合而得1。由于席夫碱在合成上具有很大的灵活性，同时席夫碱类化合物具有一定的药理学和生理学活性2，如明显的抗

6、结核、抗癌、抗菌等药理作用，使得席夫碱及其配合物的研究十分广泛。本文合成了2氨基-5硝基吡啶水杨醛席夫碱，考察了2氨基5硝基吡啶水杨醛席夫碱与牛血清蛋白(BSA)的相互作用。通过探究适宜条件下席夫碱与牛血清蛋白相互作用的紫外光谱，考查了复合物形成的最佳反应时间、反应温度、共存物质的干扰等条件，通过对实验数据的分析得到了一定条件下体系吸光度与牛血清蛋白浓度之间的线性关系，从而建立了席夫碱与牛血清蛋白相互作用的紫外分光光度法。方法操作简单，灵敏度高，可用于牛血清蛋白的快速测定。实验1.1 主要试剂和仪器TU-1810PC型紫外吸收分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司生产)，配石英比色皿(1 c

7、m)；ESJ-180型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）； HH-S-2.4型电热恒温水浴锅（山东潍坊精鹰医疗器械有限公司）；pHS-3C酸度计(上海精密科学仪器有限公司)牛血清蛋白（北京奥博星生物技术有限责任公司）；2氨基5硝基吡啶水杨醛席夫碱，自制。 5.110-5mol/L BSA溶液：称取牛血清蛋白0.3450。分子量以67000计算3，溶于蒸馏水，转移至100mL容量瓶，定容至刻度线记为A溶液。 2氨基-5硝基吡啶水杨醛席夫碱溶液：称取8.4mg2氨基5硝基吡啶水杨醛席夫碱于烧杯中，溶于适量DMF有机溶剂，转移至100ml容量瓶，定容至刻度线，记为溶液，取10ml溶液转移至100ml容

8、量瓶，加DMF定容至刻度线并摇匀，记为溶液。BR缓冲溶液的配制： 在100 ml三酸混合液(磷酸乙酸硼酸，浓度均为0.04 mol/L)中,用0.2 mol/LNaOH溶液调至不同pH值的缓冲溶液。实验用水如未特别注明均为二次蒸馏水，所用试剂均为分析纯。1.2 方法1.2.1 2-氨基-5-硝基吡啶水杨醛Schiff碱的合成 分别取1.0g（7.8mmol）2-氨基-5-硝基吡啶、水杨醛、无水乙醇于圆底烧瓶中，加热搅拌回流2h，冷却析出大量固体，抽滤，干燥，最后得到2-氨基-5-硝基吡啶水杨醛Schiff碱1.6g，产率88.4%。黄色晶体，mp:120-122。Schiff碱的合成属于缩合反

9、应，它涉及到加成、重排等过程，反应物立体结构及电子效应都起着重要作用4。反应机理如下: R1，R2，R3=H,烷基，环己基，芳香基，杂环等反应路线图如下5：1.2.2 席夫碱与牛血清蛋白的相互作用研究 于10mL比色管中，依次加入4.0mL B溶液（席夫碱溶液）、1mLA溶液（牛血清蛋白标准溶液)、2mL 0.15mol/L的pH为6.96的Tris-HCL缓冲溶液,用二次蒸馏水定容。以相应的缓冲溶液作参比6，在室温下反应50min之后，用1cm的石英标准比色皿测定353nm处的吸光度值。2 结果与讨论 21 席夫碱试剂结构表征2.1.1 红外光谱分析 以KBr压片法，在5004000cm-1

10、内扫描，2-氨基-5-硝基吡啶水杨醛Schiff碱及其络合物的红外光谱主要特征吸收数据见表1。表1 2-氨基-5-硝基吡啶水杨醛Schiff 碱及其络合物的红外光谱主要特征吸收数据（cm-1）7化合物2-氨基-5-硝基吡啶水杨醛Schiff碱1601.851565.77 1454.74 1377.022-氨基-5-硝基吡啶水杨醛Schiff碱氯化铁络合物1608.791538.01 1454.74 1384.892-氨基-5-硝基吡啶水杨醛Schiff碱氯化镍络合物1629.611604.63 1538.01 1443.64 2-氨基-5-硝基吡啶水杨醛Schiff碱氯化钴络合物1637.93

11、1607.40 1529.68 1457.52 2-氨基-5-硝基吡啶水杨醛Schiff碱乙酸铜络合物1612.951601.18 1538.01 1440.86 由表1可见，2-氨基-5-硝基-吡啶水杨醛Schiff碱在1601.85cm-1处有强吸收峰，表明存在亚氨基-C=N-，从而证明Schiff碱的形成。1565.77 cm-1、 1454.74cm-1一组吸收峰属于芳环的骨架伸缩振动8。在Schiff碱形成配合物后, C=N吸收峰的位置均发生了不同程度的位移(1608.79、1629.61、 1637.93、 1612.95cm-1), 且芳环的骨架伸缩振动也发生了位移, 如图1，说

12、明了亚胺基和吡啶环的N原子均参加了配位9。图 2-氨基-5-硝基吡啶水杨醛schiff碱2.1.2 紫外吸收光谱分析 按试验方法配制溶液，在室温下反应50min之后，分别在190-500nm范围内扫描，席夫碱和BSA在可见光区没有吸收，席夫碱的最大吸收峰是363nm（图2)，席夫碱与BSA反应生成的络合物的最大吸收波长在353nm(图4)，且在353nm处的吸光度与BSA的浓度成正比，据此拟定测定BSA的紫外吸收光谱分析方法，试验证明该方法可行。 图 席夫碱紫外光谱扫描图 图 BSA紫外光谱扫描图图 席夫碱与BSA混合后络合物光谱扫描图 图5席夫碱、BSA、席夫碱与BSA混合谱图注：1-席夫碱

13、，2-席夫碱与牛血清蛋白络合物，3-牛血清蛋白由图2可知，在pH为6.96的Tris-HCL缓冲溶液中，2氨基-5硝基吡啶水杨醛席夫碱在363nm处有一特征吸收峰（如图1曲线）；牛血清蛋白（BSA）在300400nm之间吸收很弱，（如图3曲线）；当席夫碱溶液和BSA溶液混合后，该溶液的最大吸收峰值移至353nm处（如图4曲线），与2氨基-5硝基吡啶水杨醛席夫碱相比较，紫移了10nm（如图5曲线）,这表明2氨基-5硝基吡啶水杨醛席夫碱与BSA反应生成了络合物。2.2 最佳反应条件的确定2.2.1 支持电解质NaCl浓度的影响 在室温下，将4mL、1mL，以pH为6.96的Tris-HCL缓冲溶液

14、定容，在室温下反应50min之后，改变Tris-HCL缓冲溶液中氯化钠浓度（从0.05到0.40mol/L），用光度测量分别测定在353nm处的吸光度，来考察溶液中支持电解质（NaCl）对其相互作用测定的影响，绘图如下： 图6氯化钠浓度的影响由图6可知：在pH为6.96的Tris-HCL缓冲溶液中支持电解质NaCl的浓度为0.15mol/L时体系吸光度最大。.2.2 反应时间的影响 室温下，分别将4mL、1mL,以pH为6.96的Tris-HCL缓冲溶液（内含0.15mol/的NaCl）定容至10mL，配制一系列（8组）溶液，每隔十分钟分别测定在353nm处的Abs值并作图，从而考察反应时间对

15、相互作用测定的影响13，结果见图7：图7反应时间的影响由图7可知，反应时间达到50min后，吸光度值达到最大值0.30。表明反应已完成，所以选择的反应时间为50min。2.2.3 反应温度的影响 室温下，分别将4mL、1mL、以pH为6.96的Tris-HCL缓冲溶液（内含0.15mol/的NaCl）定容至10mL分别置于恒温水浴锅中，反应时间为50min，以5摄氏度为一个温度间隔12，分别测定在15、20、25、30、35、40、45、50摄氏度下冷却至室温后在353nm处的吸光度，结果见图8。 图8反应温度的影响由图8可知：溶液的吸光度受温度影响不大，本实验选择室温下条件进行。.3. 工作

16、曲线的绘制图9BSA的工作曲线图由图9可以看出，在试验条件下，体系的吸光度值与BSA的浓度呈线性关系10，其线性回归方程为0.00306c0.0200，相关系数R2=0.99902。BSA浓度在3.45400mg/L间与吸光度具有良好的线性关系。由A=bc11表观摩尔吸光系数8.7103 Lmol-1cm-1,以3倍信噪比12（ S/N=3 ）计算检出限（n=20）为1.03 mg/L。 2.3.2 精密度 将优化条件下的2氨基-5硝基吡啶水杨醛席夫碱与BSA溶液在最佳条件下（pH为6.96的Tris-HCL缓冲溶液、反应50min、室温）混合，在353nm处测定吸光度，连续10次平行测定，结

17、果见表2。表2精密度测量序号12345678910 A 0.2970.2960.3150.2990.3010.2920.2990.3030.2940.297由表2可知：平均值为：0.2993。相对标准偏差为2.13。2.4 络合比固定BSA的用量、改变席夫碱的用量，从而形成一系列溶液（10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1），利用摩尔比法13测定席夫碱与BSA的络合比为40：1。 图10摩尔比法测定络合物组成2.5 共存物质干扰控制BSA浓度为34.5mg/L、相对误差为+5，考察Cu2+、 Fe 、Ca+以及葡萄糖对相互作用测定的影响，当测定误差不超过5时干扰物质允许倍数

18、为：Cu2+(0.32)、 Fe (0.28) 、Ca+(0.20)、葡萄糖（1.5）,由结果可知，本方法的选择性良好。2.6 回收率2.6.1 样品溶液的配制 称取牛血清蛋白0.3450，溶于蒸馏水，转移至100mL容量瓶。2.6.2 加标回收实验 取试样3.00mL于10.00mL比色管中，使得加标浓度在标准工作曲线的适宜浓度范围，采用在样品中加入已知标准样品的方法作回收率实验，结果如表3: 表3 加标回收率 样品量mg加入标准量mg加标测得量mg回收率% 0.876 1.857 93.3 1.04 1.046 2.029 94.6 0.942 1.984 100.3 0.788 0.81

19、1 97.8 由表3可知，样品回收率在93.3%100.3%之间，说明方法的准确性相对较好。3 结论采用紫外分光光度法研究了自制2氨基-5硝基吡啶水杨醛席夫碱试剂与牛血清蛋白（BSA）的相互作用。席夫碱与牛血清蛋白在电解质NaCl溶液的支持下能促进络合物的生成,从而增大吸光度。络合物最大吸收波长为353nm，与2氨基-5硝基吡啶水杨醛席夫碱试剂的最大吸收波长363nm比较，紫移了10nm，络合比为40:1，摩尔吸光系数是8.7103 Lmol-1cm-1, BSA浓度在3.45400mg/L间具有良好的线性关系, 检出限为1.03mg/L，BSA的最佳浓度为5.110-6mol/L方法操作简单

20、，灵敏度高，实验所用试剂均为实验室常备，可用于席夫碱与牛血清蛋白相互作用研究的快速测定。参考文献： 1文树基. 基础生物化学实验指导（农学类专业用）M西安：陕西科学技术出版社，1994,3(5):122-125.2冯小强,李小芳,付国庆. 壳聚糖与DNA作用的研究J.食品工业科技2010(01) :224-227.3汪家政,范明.蛋白质技术手册M.山西：科学出版社 2000，(46):342-346.4陈绘丽. 用核磁共振等方法研究金属配合物与脱氧寡聚合苷酸的作用 J.生物化学2003(03):441-447.5黄琦,赖依峰,钟文英.帕珠沙星与DNA相互与作用的研究J.中国新药杂志2009,2

21、4（06）:177-184.6叶勇, 严振寰.2氯代苯甲醛丙氡酸希夫碱类抗痛药物对DNA作用的谱学研究J.化学工业科技1998,21（01）:99-104.7高晁杨,陶慧林,刘铮,黄上元. 紫外光度法研究邻香草醛缩苯丙氨酸席夫碱与牛血清蛋白的相互作用J.化学与生物工程 2009,16(02):45-48.8 颜力楷，苏忠民.乙二胺双Schiff碱及其Ni(II)配合物的电子结构和非线性光学性质的INDOCI研究J.高等学校化学学报，2006，27(4):711-7159 赵丰,刘雷雷,孙婷. 席夫碱保护DNA能力的研究 J.生物制药工程 2008（09）:127-127.10徐静.水杨醛缩8-

22、氨基喹啉及水杨醛缩乙二胺Schiff碱Mn、Fe配合物的制备及生物活性研究D.贵州：贵州大学，2010,15(05):76-79.11刘鸿，金真，彭忠利.水杨醛缩邻氨基苯甲酸Schiff碱稀土配合物的合成J.化学研究与应用，2011, 23(7)：902-906.12 Harvey,M.J.,Nordstrom,F.,Parkin,S.,et a1.Salen-type compounds of Calcium and StrontiumJ. Inorg.2009,12(6):122-127.13Patel,S.A.,Sinha,S.,Mishra,A.N.et a1.Olelin epoxi

23、dation catalysed by Mn()Schiff base complex in hetterogenised-homogcneous.2010,27(9):193-197.致谢本论文是在菏泽学院化学与化工系庞艳玲老师的严格把关下精心指导完成的，从选题到开题报告，实验前的材料准备、实验中的细节、以及实验结束写作提纲，从来都是严格把关，循循善诱，在此我表示衷心的感谢。同时我还要感谢实验过程中孟德素老师的指导以及李文克同学的的帮助。毕业论文的完成是结束也是新的学习生活的开始，由于我的学术水平有限，所写论文难免有不足之处，恳请各位老师和学友批评和指正！在此过程我学到了很多，也将怀着一颗感恩的心再接再厉。 李伟栋2014年5月于菏泽学院