2分子克隆.ppt

1、第二章 DNA克隆技术,本章，我们讨论4个问题：1.什么是DNA克隆技术DNA克隆技术的概念。2.为什么能进行DNA克隆技术DNA克隆技术的原理和技术路线。3.怎样进行DNA克隆技术DNA克隆技术的步骤（DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理）4.DNA克隆技术的应用和前景对于医学来说即生产基因工程产品、开展基因治疗等。,DNA重组/基因重组,利用酶学方法，将不同来源的DNA分子（目的DNA分子和载体）在体外进行特异切割、重新连接，组装成一个新的DNA分子。,DNA克隆/基因克隆/分子克隆,将重组的DNA通过一定方式导入宿主细胞内，并且在宿主细胞中进行复制扩增，形成

2、大量与亲代分子完全相同的子代DNA分子的过程。,克隆的含义DNA克隆：分子水平细胞克隆：细胞水平克隆羊：无性繁殖 个体水平,（一）基因（gene）基因 从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。（二）基因工程（genetic engineering）基因工程 有目的的通过分子克隆技术，人为操作改造基因，改变生物的遗传性状的系列过程，总称为基因工程。,第一节 概论,一、历史1944 肺炎双球菌转化实验证实DNA是遗传物质1953 DNA双螺旋模型1960s 遗

3、传密码、中心法则1970 反转录酶1946 质粒1968-70 限制酶1972 不同来源的DNA片段体外连接成重组DNA分子1973 转化、筛选重组质粒的阳性克隆,The transforming principle is DNA.,DNA is the genetic material,肺炎双球菌转化实验,The Double Helix(1953),The foundation of molecular biology,Francis H.Crick James D.Watson,中 心 法 则,二、基因克隆的特点和技术路线,技术路线：1 分离制备目的DNA片段和载体 2 目的DNA与载体

4、的剪切 3 目的DNA与载体的连接 4 重组DNA分子转化宿主细胞 5 筛选阳性克隆，大量扩增特点：分子水平操作，细胞水平表达,基本原理,基因克隆技术路线,切,接,转,筛,分,常用的工具酶（tool enzymes）有：1.限制性核酸内切酶（resriction enzymes,restriction endonadease)2.DNA连接酶（DNA ligase,ligase)3.逆转录酶(reverse transcriptase)4.DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol)5.核酸酶(nuclease)6.末端转移酶(terminal transferase)7.碱性

5、磷酸酶(BAP或CIP)以1.和2.最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。,第二节 工具酶,一、限制性内切酶定义：特异性识别双链DNA并进行切割的酶。内切：在DNA内部切割 限制性：识别特异位点切割-GAATTC-CTTAAG-EcoR酶切位点,命名（1973年Smith 原则、型酶）根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。第一个字母大写 该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写 该微生物种名前的2个字母第四个字母大写 有变种或品系的第一个字母罗马字母、从一种微生物中发现了几种不同特异性限 制酶，按发现顺序排列 如EcoR是指从大肠杆菌（Escherichia coli）R 株分离得到的

6、第一种限制酶。,命名酶的来源 Haemophilus influenzae d 属名 种名 株系酶的名称 Hind,分类 DNA底物 双链DNA 双链DNA 双链DNA 辅因子 Mg2+ATP SAM Mg2+Mg2+ATP 识别序列 特异 特异 特异切割位点 非特定 特定 特定 识别序列前后 之中 之后25bp27bp 100-1000bp修饰作用 有 无 有,限制酶的识别位点 一般特征（4点）：（1）型酶识别的特殊DNA序列称为限制酶的识别位点（或切割位点）。（2）它能识别DNA的46bp的回文序列并水解该部分的核苷键。一般来说是46bp，有6个以上的，但没有4个以下的。（3）识别顺序呈二

7、重对称，即1800旋转对称。如：(4)酶靶顺序大小是很重要的，它决定产生特定DNA中段的大小。若DNA碱基组成是均一的，限制酶切点是随机的，那么对于：要求4bp靶序列如Hpa,Mbo等在庞大DNA链上平均44核苷酸即可遇到一个靶序列，即1/256 同理，要求6bp的酶，则平均46遇到一个靶序列，即1/4096。,GGATCCCCTAGG,BamH,特点型限制酶：识别4-6个核苷酸 识别的核苷酸具有回文结构 可以形成平末端、粘末端 切口概率 星号活力,星号活力定义：限制酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异识别的序列类似的序列的现象。影响因素：甘油浓度过高，低离子强度，限制酶用量过大，高PH

8、，有机溶剂污染表示方法：在相应的酶上加星号表示。如：EcoR（*）,如EcoRI切割后产生5末端突出的粘性末端；5GAATT C3 5G-OH p-AATTC3 3C TTAAG5 3CTTAA G5PstI切割后产生3末端突出的粘性末端：5C TGCAG3 5CTGCA-OH p-G3 3GACGT C5 3G ACGTC5还有一些酶沿对称轴切割DNA，产生平端或钝端（blunt end）如SmaI:5CCCGGG3 5CCC GGG3 3GGGCCC5 3GGG CCC5,型限制酶切口特点,1异源同工酶（Isoschizomers）也称同裂酶:来源不同，识别顺序相同，切割方式可同可不同：(

9、1)识别顺序与切割方式同，如：Mbo和 SauS（NNGATCNN-3）-NNCTAGNN-5(2)识别顺序同，切割位点不同，如：Sma CCCGGG 和 Xma CCCGGG(3)识别与切割相同，但其中一酶可以切“修饰”（甲基化*），另一酶不能。如：HpaCCGG 和 MspCCG*G MboGATC 和 Sau 3A GA*TC,几种特殊的内切酶,2.一个位点包含在另一个位点之中 Hpa CCGG Sma CCCGGG Sma的6个bp含Hpa的4个bp顺序，所以Hpa 能识别与切割Sma的6个bp，但含有Hpa的ccgg的其它6核苷酸 顺序不能被Sma切割。3同尾酶 指来源不同、识别靶序

10、列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。BamH G GATC C Bcl T GATC A C CTAG G A CTAG T,杂种位点（hybrid site）由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。BamH G GATC C Bcl T GATC A C CTAG G A CTAG T 杂种位点：G GATC A C CTAG T,二DNA连接酶 1.DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码 粘末端连接 NAD+供能 2.T4 DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码 粘末端、平末端连接 已知唯一平末端连接酶 ATP供能,DNA连接酶是基因工程重要

11、的工具酶，常用T4DNA ligase.（一）功能：催化有互补顺序的两个DNA分子的粘性末端或平头末端3OH、5P连接作用。（二）来源噬菌体T4感染E coli分离的一种单链多肽酶、MW.68KD。（三）催化反应：需要ATP、Mg2+作辅助因子；对粘性末端催化活性大于平头末端,DNA连接酶在限制片断的末端连接作用 分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。,三、聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶（全酶）大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow大片段 T4噬菌体DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 反转录酶

12、（依赖于RNA的DNA聚合酶）AMV MLV,（1）53DNA聚合酶活性（2）35外切酶活性（3）53外切酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶（全酶）,酶用途：,酶活性：,（1）cDNA第二条链的合成（2）3凹陷粘末端的标记，平端化（3）缺口平移法标记DNA探针,5 3DNA聚合酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶的大片段Klenow片段酶 基因工程很多情况下，E.coli DNA pol可用它的1个大片段Klenow片段酶代替。酶活性：1.53DNA聚合酶，2.35外切酶活性。酶用途：(1)补平3凹陷粘性末端(2)同（1），填平过程中，用32P dNTP标记DNA片段3末端。(3)cD

13、NA克隆中，用于合成cDNA的第二条链。(4)在Sanger双脱氧法 ddNTP系统进行序列分析。,1.来源 源于T4噬菌体感染的E.coli。2.酶的活性，相似于Klenow片段，但远远强于Klenow片段（1）53 聚合活性（2）35 外切酶活性 3.基因工程中用途与Klenow片段一致（标记末端，填平5末端），不同的是可对3突出端的DNA分子进行标记。这是用其强劲的35外切酶活性切除3突出端，产生3凹端。,T4噬菌体DNA聚合酶（T4 DNA pol）,反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）,催化以RNA为模板反转录生成 DNA。最初禽类成髓细胞中分离。主要用于反转录mRNA生成cDNA

14、。,RNA指导的DNA合成反应；RNA的水解反应；DNA指导的DNA合成反应。,AMV：42 MLV：37,分类,作用,活性,反转录酶,反转录酶还具有RNaseH活性,碱性磷酸酶酶活性：催化核酸的5 端脱磷酸反应酶用途:5 末端标记和防止载体自身连接,基本原理,目的基因的获取,DNA导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,目的基因与载体,因子两端正好有两个酶切位点BamH和EcoR，切割后得到1500bp的片段。,一、目的基因的获取方法,1、染色体DNA的限制性内切酶酶切片段,2、通过mRNA反转录合成 cDNA,DNA聚合酶,碱水解,T T T

15、T,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,3、从基因组DNA文库获取目的基因,4、从cDNA文库获取目的基因,8、最常用的方法：索取,5、PCR扩增目的基因,6、人工体外合成基因片段,7、根据蛋白质序列推导,基本原理,目的基因的获取,DNA导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,二、载体 能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。特性：1 复制起点 2 多克隆位点：多种限制酶的单一切割位点3 筛选标志 Amp+Kan+Neo+4 分子量不宜过大 否则易断裂、转化效率低5 表达载体:还要有P、E、前

16、导序列、加尾信号、信号肽、核 定位序列等,载体的分类,质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对，一般310kb。常有1-3个抗药性基因，以利于筛选。在子细胞中保持恒定的拷贝数并表达其遗传信息，如抗药性。具有自主复制的能力，但不能独立存活。接受的DNA大小有限，小于15kb.,存在于细菌细胞质中 双链环状DNA分子 大约 310 Kb 具有自主复制和转录能力 不能独立存活 在子细胞中保持恒定的拷贝数并表达其遗传信息,特性,15 kb 一般310 Kb 左右,接受的DNA片段长度,主要用于外源基因的克隆和保存，是一种比较原始的克隆载体。pBR322：B,bacteria;R,Resistance.,pBR322,3、常用质粒,pBR 322 4361 bp Tetr AmprpUC 18/19 2686 bp Ampr LacZ pGEM-3Z 2743 bp Ampr LacZpUC 118/119 3162 bp Ampr LacZ,噬菌体（bacteriophage）,特点：约50kb，容纳1822kb片段线性双链，天然粘性末端感染宿主细