枇杷采后储藏过程中类胡萝卜素.docx

1、枇杷采后储藏过程中类胡萝卜素本 科 生 毕 业 论 文 枇杷采后贮藏过程中类胡萝卜素含量的变化研究徐立影院 系： 环境与生命科学系 专 业： 应用化学 班 级： 082 学 号： 810304213 指导教师： 陈 宇 职称（或学位）： 讲 师 二零一二年 五 月原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文（设计），是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文（设计）不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本论文（设计）的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学生签名： 年 月 日 指导

2、声明本人指导的 同学的毕业论文（设计）题目大小、难度适当，且符合该同学所学专业的培养目标的要求。本人在指导过程中，通过网上文献搜索及文献比对等方式，对其毕业论文（设计）内容进行了检查，未发现抄袭现象，特此声明。指导教师签名： 年 月 日目 录1 材料与方法 21.1 供试材料 21.2 主要试剂与仪器 21.3实验步骤及方法 32 结果与分析 42.1 傅立叶红外光谱的表征 42.2 叶黄素、-隐黄质及-胡萝卜素标样的检测 52.3 枇杷类胡萝卜素的测定结果 62.4 枇杷果实贮藏过程中主要色素的含量变化 83 讨论 94 结论 10致谢 10参考文献 10枇杷采后储藏过程中类胡萝卜素含量的变

3、化研究徐立影（环境与生命科学系 指导教师：陈宇）摘要：分析枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)果实在采后贮藏过程中类胡萝卜素的含量变化，探讨枇杷果实在贮藏过程中外观颜色的变化机理。以“早钟六号”枇杷为试材，使用混合溶剂正己烷丙酮无水乙醇=211(vvv)提取贮藏过程中不同温度下的“早钟六号”枇杷中的类胡萝卜素，建立了测定“早钟六号”枇杷采后贮藏过程中类胡萝卜素含量的反相高效液相色谱分析法。通过两种流动相配比，检测出三种类胡萝卜素组分，且“早钟六号”枇杷在采后贮藏过程中，8环境下的枇杷果实类胡萝卜素成分均比较稳定，果实颜色深的枇杷-胡萝卜素的含量也高，叶黄素次之。结果表明

4、，枇杷在采后贮藏过程中类胡萝卜素各组分积累的含量变化会影响其果实的外观颜色，且枇杷果肉色泽的深浅与-胡萝卜素含量的高低有很大关系。-胡萝卜素的含量越高，其果实的颜色越深。而对于贮藏温度，8是比较适宜枇杷贮藏的环境温度。关键词：枇杷果肉；贮藏过程；类胡萝卜素；叶黄素；-隐黄质；-胡萝卜素Loquat Postharvest Storage Process of Carotenoids Changes of The Contents of ResearchXu Liying（Department of Environment and Life Sciences, Supervisor: Chen

5、Yu）Abstract: This experiment was aimed to analysis loquat (Eriobotrya japonica Lindl.) in fruit postharvest during storage variation in content of carotenoids, in order to explore the change mechanism of loquat fruit in storage appearance. Zaozhong NO.6 Lindl as materials, use hexane: acetone: ethan

6、ol absolute = 2:1:1 (v: v) extraction process of storage in different temperature of Zaozhong NO.6 the loquat carotenoids, established the determination Zaozhong NO.6 Lindl postharvest during storage of carotenoids content of the high performance liquid chromatographic analysis method. Two kind of f

7、low is matched to the store process the content of carotenoids method. Testing out three kinds carotene components, and Zaozhong NO.6 Lindl after mining in storage period, in the environment of loquat fruit 8 carotenoids ingredients are relatively stable, fruit color deep loquat beta carotene conten

8、t is also high, lutein take second place. The results show that the Loquat after mining in store process of carotenoids accumulation of various components of the content change affect the appearance of the fruit color, and the depth and color loquat fruit pulp beta carotene content there is a great

9、relationship between the high and low beta carotene content is higher, the color is more deep and fruit for storage temperature, and is suitable for storage of loquat is environmental temperature.Key words: loquat fruits; storage process; carotenoids; lutein; -cryptoxanthin; -carotene枇杷(Eriobotrya j

10、aponica Lindl.)系蔷薇科枇杷属常绿乔木，是呼吸非跃变型1-2。原产地在中国东南部，因果子的形状似乐器琵琶，故而得此名。它口感好、品质极，营养价值很高，深受人们喜爱，属于附加值很高的水果之一。在我国福建地区，枇杷果实成熟期多集中在4-5月份，但其果实采后极不耐贮藏和远运。同时在果实采后贮藏过程中也会呈现出许多生理生化变化，枇杷果实的颜色不仅是其重要的特征性状，更是重要的经济性状。类胡萝卜素作为21世纪抗氧化剂时代的“新贵” 3，广泛存在于橙色、黄色果实中，其组成和含量不仅决定了果实的外观颜色和商品性，而且也在清除体内自由基、提高免疫力和延缓衰老等方面起着重要作用，具有十分美好的市场

11、前景而被国内外各界广泛关注。枇杷中富含多种类胡萝卜素，目前，有关枇杷的采后技术及其生理生化的研究虽已有不少4-5。但是到目前为止，国内外关于枇杷果肉在采后贮藏过程中类胡萝卜素的含量及组分的变化分析却未见报道。本实验以“早钟6号”枇杷果肉为试验材料，比较研究了枇杷果实在采后贮藏过程中不同温度下的类胡萝卜素的含量变化，探讨了枇杷果实在贮藏过程中外观颜色的变化机理，在一定程度上为枇杷贮藏过程中颜色的变化做出了解释。1 材料与方法1.1 供试材料 以成熟的“早钟6号”枇杷果实为试验材料，成熟度相同，大约为九成，果色为橙黄，选取120个外观无机械损伤和病虫害且大小颜色均匀的枇杷，40个枇杷为一组，分别贮

12、藏在4、8和室温的环境下；在日后的提取、测定过程中，每次每组均选取2个表面完好、无明显腐烂的枇杷果实为样品。1.2 主要试剂与仪器表1 主要药品、试剂及规格药品及试剂生产厂家纯度规格正己烷天津市永大化学试剂有限公司分析纯无水乙醇天津市永大化学试剂有限公司分析纯丙酮天津市永大化学试剂有限公司分析纯甲醇天津市永大化学试剂有限公司分析纯氢氧化钾天津市永大化学试剂有限公司分析纯无水硫酸钠浙江兰溪二轻试剂厂分析纯2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）天津市光复精细化工研究所分析纯甲醇国药集团化学试剂有限公司色谱纯乙腈国药集团化学试剂有限公司色谱纯二氯甲烷国药集团化学试剂有限公司色谱纯-胡萝卜素美国Sigma公

13、司叶黄素美国Sigma公司-隐黄质美国Sigma公司表2 主要仪器及型号仪器生产厂家型号台式高速冷冻离心机上海力申科学仪器有限公司Neofuge 23R电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司Sartorius BS224S石英自动双重纯水蒸馏器常州国华电器有限公司1810-B型玻璃仪器气流烘干器郑州长城科工贸有限公司星火牌C型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司KQ5200E型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司DHG-9246A型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂RE52CS-1型循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司SHB-电热恒温水浴锅恒奇企业发展有限公司H.S.G IC-2型TDA-

14、温控仪余姚江南仪器仪表厂8002型冰箱青岛海尔股份有限公司BCD-215SCX型移液枪一套德国艾本德有限公司Eppendorf型红外光谱仪日本岛津有限公司TENSOR 27型高效液相色谱仪美国安捷伦科技有限公司Agilent Lc1100型1.3实验步骤及方法1.3.1 枇杷类胡萝卜素的提取类胡萝卜素的提取参照胡建中等6及熊作明等7的方法并略作修改，分别从不同温度环境下取出两个枇杷，各称取5 g枇杷果肉，加入30 mL混合有机溶剂（正己烷无水乙醇丙酮=211（体积比）充分研磨后转入50 mL离心管中，然后在5，转速8000 rmin-1下离心5 min，收集上层清液。沉淀继续用10 mL混合溶

15、剂提取，直至沉淀为无色，合并有机相。1.3.2 HPLC的样品制备用旋转蒸发的方法将提取液蒸发浓缩至干，用20 mL的正己烷进行溶解，转入棕色瓶中，加入15 mL的6%KOH甲醇溶液，向其内部充入氮气后并在常温下置于暗处皂化反应12 h。向皂化液中加入10 mL的重蒸水，正己烷进行萃取，用分液漏斗弃去下层，收集正己烷相并用无水硫酸钠除去水分，然后旋转蒸发将其浓缩至2 mL左右，再用正己烷定容至5 mL，最后浓缩液用0.45 m的微孔滤膜过滤后装入2 mL样品瓶中，使用高效液相色谱仪来对其进行分析做准备。2.3.3 样品的红外光谱分析将样品用玻璃棒蘸取少量滴于KBr晶片上，在0-4500 cm-

16、1波长下进行红外光谱分析，初步确定提取样品中类胡萝卜素的种类。1.3.4 枇杷类胡萝卜素的HPLC分析将定容后的2 mL样品液依次放入高效液相色谱的自动进样器中，高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）包括VWD检测器，四元梯度泵，Agilent 1100自动进样器，色谱工作站为Agilent 1100 HPLC化学工作站。色谱柱的柱型：反相ZORBAX SB-C18的色谱柱(4.6150 mm)，粒径为5 m。采用自动进样法，进样量10 L。在高效液相的色谱条件探讨上，流动相的配比选择是关键8。枇杷中类胡萝卜素的HPLC分析参照赵平娟等9及李娟等10的方法并稍作修改，确定了下面两种检测方法：方法一（

17、叶黄素的检测条件）：ZORBAX SB-C18的色谱柱(4.6150 mm)，流动相为甲醇乙腈二氯甲烷=57025（vvv），流速为0.7 mLmin-1，检测波长为450 nm，柱温25。方法二（-隐黄质及-胡萝卜素的检测条件）：ZORBAX SB-C18的色谱柱(4.6150mm)，检测波长为450 nm，柱温25。梯度洗脱：0 min：甲醇乙腈二氯甲烷=81172（vvv）；0 -15 min流动相为甲醇乙腈二氯甲烷=81172（vvv），流速为1.0 mLmin-1；1516 min：甲醇乙腈二氯甲烷=81172（vvv），流速增至1.5 mLmin-1；1640 min：甲醇乙腈二氯

18、甲烷=81172（vvv），流速保持1.5 mLmin-1不变。用Agilent 1100 HPLC仪来检测分析，通过保留时间来定性类胡萝卜素的种类，再以峰面积来定量。2 结果与分析2.1 傅立叶红外光谱的表征类胡萝卜素是高度不饱和多烯化合物，含有一些列的不饱和双键和共轭烯键。几种类胡萝卜素的化学结构式如图1所示。图1 几种类胡萝卜素的化学结构式由于每种分子都有其独特的红外吸收光谱，故据此可对样品成分进行初步确定。图2为样品的红外光谱图。对照红外光谱图解析集及图2可知，在2960-2856 cm-1波长处有明显的吸收峰，说明在此处有C-H伸缩振动。1463 cm-1可能为C=C伸缩振动低场位移

19、，因为长的双键共轭时C=C会像低波数移动。1379 cm-1也存在吸收峰，说明在此处存在CH3、CH2的CH弯曲振动。而在3300 cm-1处也有一较明显的谱带，对照相关文献11可知，此处为OH的伸缩振动吸收峰。723 cm-1属于顺式单烯双取代的剪切振动吸收峰范围内，故可知此样品中也存在顺式单烯结构。综合以上分析，该结果与类胡萝卜素的结构相符，初步说明该样品中含有类胡萝卜素。 图2 “早钟六号”枇杷样品的红外光谱图2.2 叶黄素、-隐黄质及-胡萝卜素标样的检测 实验表明，在上述方法一、方法二检测条件下，叶黄素、-隐黄质及-胡萝卜素标准品在高效液相色谱中的峰形和分离度均较好，叶黄素标准品在本实

20、验中的保留时间为3.471 min，-隐黄质及-胡萝卜素标准品的保留时间分别是11.962 min和34.056 min。图3为1 mgmL-1叶黄素标准品的HPLC色谱图，图4为1 mgmL-1-隐黄质标样HPLC色谱图，图5为100 gmL-1-胡萝卜素标样HPLC色谱图。 图3 叶黄素标准品的HPLC色谱图 图4 -隐黄质标准品的HPLC色谱图 图5 -胡萝卜素标准品的HPLC色谱图2.3 枇杷类胡萝卜素的测定结果依据保留时间将枇杷果实提取液样品中的被分离物质在高效液相色谱上定性。枇杷样品中的叶黄素在本实验中的保留时间是3.464-3.483 min,-隐黄质为11.912-12.033

21、 min,-胡萝卜素为33.855-34.740 min。利用方法一测定贮藏过程中不同温度环境下的枇杷叶黄素HPLC色谱图见图6。图7为方法二测定的枇杷果实在贮藏过程中不同温度环境下-隐黄质及-胡萝卜素HPLC色谱图。结果表明，用同一种流动相对不同贮藏温度下的样品进行测定，得到的色谱图基本一致，但是检测出的类胡萝卜素的峰高不同，说明不同贮藏温度下的枇杷类胡萝卜素的种类基本相同，但含量不同。同时结果还表明，样品在不同的流动相配比下洗脱各样品，所得样品的分离度和保留时间都有很大差别。利用方法一检测样品，只找到一种叶黄素与样品的出峰时间吻合；而方法二下的样品检测，也只检测出-隐黄质和-胡萝卜素两种成

22、分。这可能是由于本实验使用的是C18色谱柱，它是一类非极性柱，多用于一些非极性物质的分离12。但从分离类胡萝卜素的效果来说，C30对其分离效果专一性更强。特别是对类胡萝卜素同分异构体的分离，更能体现其优越性6。故限于实验室的条件，在此两种流动相配比下，样品的分离效果均不是很理想。本实验只检测出三种类胡萝卜素成分，其他类胡萝卜素的标样未能测出。图6 不同温度环境下贮藏过程中枇杷叶黄素HPLC色谱图图7 不同温度环境下贮藏过程中枇杷-隐黄质及-胡萝卜素HPLC色谱图2.4 枇杷果实贮藏过程中主要色素的含量变化2.4.1枇杷贮藏过程中叶黄素的含量变化依据HPLC色谱图中的峰面积进行定量分析，叶黄素在

23、采后贮藏过程中的含量变化如图8所示。由图8可以看出，采后枇杷果实中叶黄素在不同温度环境下的贮藏过程中含量变化存在较大的差异。贮藏初期，8及室温环境下的叶黄素含量均升高，且室温下的叶黄素含量升高较快。但在贮藏14d以后，室温环境下枇杷果肉的叶黄素明显呈下降趋势，而8环境下的叶黄素含量则继续升高。且通过观察，室温下的枇杷有出现缩水变皱颜色变深现象，出汁率也下降。此时枇杷的腐烂率已达60%以上，大约在室温贮藏21d以后，剩余枇杷均腐烂。4环境下的枇杷果肉叶黄素在贮藏过程中一直呈现下降趋势，且观察可知枇杷果实颜色稍微变淡些。这与李维新等4对“早钟六号”枇杷采后生理与贮藏特性的影响研究结果相一致，即4环

24、境下枇杷果肉的呼吸会出现反弹现象。经过以上分析可以初步说明，叶黄素含量的多少与枇杷果实颜色的深浅有关系，颜色深的较颜色浅的叶黄素含量高。同时，虽然“早钟六号”枇杷是非跃变型果实1-2，贮藏温度越低，呼吸强度就越低，但也不是贮藏温度越低越好。 图8 不同温度下的枇杷果实贮藏期间叶黄素含量的变化图2.4.2 枇杷贮藏过程中-隐黄质及-胡萝卜素的含量变化通过方法二及现有的HPLC条件，本实验共检测出枇杷样品中的-隐黄质和-胡萝卜素两种成份。采后枇杷在不同环境下的贮藏过程中，-隐黄质和-胡萝卜素两种成分的含量变化分别如图9和图10所示。图9 不同温度下的枇杷果实贮藏期间-隐黄质含量的变化图图10 不同

25、温度下的枇杷果实贮藏期间-胡萝卜素含量的变化图由图9可知，-隐黄质的变化趋势可参照叶黄素的变化趋势进行解释。不同的是8环境下的枇杷-隐黄质在12d左右时就达到最大值，而后就呈现缓慢降低的趋势。图10则表明，不同温度下的枇杷果实贮藏期间-胡萝卜素含量的变化也不同。具体地，8环境下的枇杷-胡萝卜素含量基本没变化，而4环境下的枇杷在贮藏20 d左右时，含量有些突变，而后又稍微升高一点。室温环境下的-胡萝卜素含量仍然呈先增加后减少的趋势，且在13d左右时变化非常明显，-胡萝卜素含量达到最大值。3 讨论枇杷在采后贮藏过程中，不仅色泽和硬度在发生变化，其果实中类胡萝卜素的含量也发生明显的变化。而许多植物的

26、花、果实的颜色又与其自身内部积累的类胡萝卜素含量和种类有关。陶俊等13的研究认为，柑橘果实的颜色差异是由于其积累的类胡萝卜素组成比例及含量不同引起的。本实验研究结果表明，不同温度环境下的枇杷果实，其内部积累的类胡萝卜素的成分基本是一致的。但在贮藏过程中，随着贮藏天数的增加及枇杷本身颜色的变化，使得各组分含量发生变化。根据峰面积的大小可以确定，叶黄素和-胡萝卜素含量在贮藏过程中均较多，但-胡萝卜素始终占主要优势，因此可以确定-胡萝卜素对于枇杷果实颜色的贡献作用大于其他已检测出来的类胡萝卜素种类。这与杨祥燕等14关于菠萝果肉颜色与类胡萝卜素组分关系的研究结果是一致的。同时由结果可知，枇杷果实在贮藏

27、过程中，4和室温环境下的枇杷在贮藏过程中，类胡萝卜素组分的变化均较8环境下明显，且枇杷果实的颜色、硬度及耐贮性均比8环境差，由此可得出8是比较适宜枇杷贮藏的环境温度。这与李维新等4关于低温贮藏对采后枇杷的特性影响结果一致。采后枇杷果实的耐贮性与气体成分、贮藏温度等外界的环境因子有密切关系，所以要保持枇杷的较好品质，就要为其提供适宜的温度等条件15-16。当然除此之外，枇杷本身的品种及采收成熟度也会影响其贮藏品质及内部成分的含量变化，但具体的调节机理还有待进一步研究。4 结论利用两种流动相配比及现有的HPLC条件，在枇杷果实样品中共检测出叶黄素、-隐黄质和-胡萝卜素三种类胡萝卜素组分。同时，枇杷

28、在采后贮藏过程中类胡萝卜素各组分积累的含量变化会影响其果实的外观颜色，且枇杷果肉色泽的深浅与-胡萝卜素含量的高低有很大关系。-胡萝卜素的含量越高，其果实的颜色越深。而对于贮藏温度，8是比较适宜枇杷贮藏的环境温度。致谢我的毕业论文实验让陈宇老师花费大量的心血，陈宇老师自始至终无私地为实验做指导，她渊博的学识，开阔独特的科研思维，严谨的治学态度，热忱负责的工作作风以及为人处事的方式都将使我受益终生。借此论文完成之际，谨向陈老师表示衷心的感谢和崇高的敬意；同时我还要感谢其他老师和同学的热心帮助与支持！参考文献1 郑重禄. 枇杷果实采后生理研究概述J. 2004全国枇杷学术研讨会论文集, 2004:

29、63-65.2 秦 文, 雷 激. 枇杷果实采后衰老生理和冷害生理的研究J. 2004全国枇杷学术研讨会论文集, 2004: 66-67.3 李 涛. 类胡萝卜素: 抗氧化剂时代的“新贵”R. 中国食品质量报, 2009: 1-2.4 李维新, 何志刚, 林晓姿. 低温贮藏对早钟六号枇杷采后生理与贮藏特性的影响J. 华南热带农业大学学报, 2005, 11(3): 1-4.5 刘 勤, 俞炳呆, 王薛修. 贮藏条件对枇杷贮藏期及主要品质和生理变化的影响J. 南京农业大学学报, 1994, 17(1): 27-31.6 胡建中, 王可兴, 潘思轶. 高效液相色谱法测定柑橘汁中类胡萝卜素J. 食品

30、科学, 2006, 27(12): 634-636.7 熊作明, 周春华, 陶 俊. 不同类型枇杷果实着色期间果肉类胡萝卜素含量的变化D. 中国农业科学, 2007, 40(12): 2910-2914.8 沈 波, 楼志华, 谢小波, 等. HPLC测定网纹甜瓜类胡萝卜素含量方法研究J. 北方园艺, 2009(11): 54-56. 9 赵平娟, 邓立刚, 李增梅, 等. 番茄及其制品中番茄红素反相高效液相色谱法测定J. 中国调味品, 2008(11): 64-65.10 李 娟. 橙色大白菜类胡萝卜素和黄酮提取测定方法及其积累规律的研究D. 西北农林科技大学, 2008(01). 11 李

31、晓银. 柿子皮中类胡萝卜素化合物的分离鉴定及稳定性研究D. 西北工业大学, 2006: 52-53.12 沈小婉. 色谱法在食品分析中的应用Z. 北京. 北京大学出版社, 1992: 142.13 陶 俊, 张尚隆, 张良诚, 等. 柑橘果皮颜色的形成与类胡萝卜素组分变化的关系J. 植物生理与分子生物学学报, 2003, 29(2): 121-126.14 杨祥燕, 蔡元保, 张光明, 等. 菠萝果肉颜色的形成与类胡萝卜素组分变化的关系J. 果树学报, 2010, 27(1): 135-139.15 鲁周民, 吴万兴, 张忠良, 等. 不同低温条件对枇杷的保鲜效果研究J. 制冷学报, 2004