云大基因工程实验报告.docx

1、云大基因工程实验报告基因工程实验报告学院：生命学院班级：生技092学号：姓名：基因工程实验技术目录实验一、动物组织RNA提取实验二、RT-PCR扩增目的基因cDNA实验三、核酸琼脂糖电泳分析实验四、质粒的提取实验五、表达载体和目的片断的酶切实验六、载体和外源DNA的连接实验七、感受态细胞的制备及转化实验八、重组质粒筛选、鉴定及转化实验九、目的基因诱导表达实验十、Western Blotting 检测附录1 DNA的纯化与回收附录2 培养基制备和细菌培养附录3 小鼠-actin基因序列附录4 表达载体pGEX 4T-1图谱小鼠-actin基因的克隆与表达实验流程图小鼠-actin基因的克隆与表达

2、1 动物组织mRNA提取（Trizol法）1.1试验原理：RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被

3、降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性。并有助于除去非核酸成分。1.2材料小鼠肝脏或肌肉组织。1.3 仪器设备高速冷冻离心机、低温冰箱、核酸电泳设备、液氮罐、研钵、剪刀、镊子、电泳仪系统、凝胶成像系统等1.4试剂配制及器具处理1、0.1的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）2、器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在0.1的DEPC H2O中浸泡过夜（37），高压灭菌，

4、80烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160烘烤6h以上。3、无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶装重蒸馏水，按0.01%（体积/体积）加入的DEPC处理过夜，拧松瓶盖，高压灭菌。80烘4h以上。4、Trizol5、75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。6、氯仿7、异丙醇8、 TAE缓冲液（50）：用时需稀释50倍9、 点样缓冲液Loading buffer（10）：0.25%溴酚蓝，40%甘油10、 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶。注意：EB具致癌作用。11、 琼脂糖1.

5、5 操作步骤1.51 Trizol法提取总RNA 先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 室温放置5min，然后加入200l的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500l异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm离心10min。 小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4下12

6、000rpm离心5min。 重复步骤。 弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥510min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30l DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可5560水浴 10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70。 注 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。 加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4保存一周，-20保存一年。试剂作用：Trizol： Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时

7、保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。DEPC：DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15

8、分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。氯仿： 氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震

9、荡，很容易使得DNA的亲水基团，与水相接触。所以不能剧烈震荡。异丙醇：异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。实验结果：MarkRNA实验分析:电泳照片中的拖尾现象还是比较严重，可能由于RNA在提取过程中有降解。能引起RNA降解的原因：1. 新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。2. 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降

10、解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。3. 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。 4. 外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。5. 内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过

11、多；匀浆时温度过高。也有可能是由于蛋白质或DNA杂质未除净引起的拖尾现象。1. 混有蛋白：不要使用过多菌体。经溶液P1、P2、P3处理，离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心去除后再进行下一步骤。2. 混有基因组DNA：加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。3. P3溶液加入时间过长：P3溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。2 RT-PCR扩增目的基因cDNA2.1实验目

12、的学习从细胞或组织中的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。2.2实验原理真核生物的基因组中通常分为可转为mRNA的外显子和不转录的成mRNA的内含子，所以从染色体DNA用PCR方法扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表达。逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶，在反义引物或oligo（dT）的引导下合成mRNA互补的DNA，再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。2.3实验试剂与设备 RNA模板 Olig（dT）18 反转录缓冲液 dNTP M-MULV反转录酶 RNA抑制剂（

13、RNasin） Pfu DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶 10PCR buffer 特异引物（PCR）设备：PCR扩增仪、电泳仪、台式离心机、恒温水浴、微量移液器2.4实验步骤1、RNA的反转录 在小EP管中依次加入：RNA模板 3 lOlig（dT）18引物 1LDEPC H2O 8 L混合后，70水浴5 min（破坏二级结构），再冰浴5min。 在管中依次加入 (反应体系为20 L)：RT 5buffer 4LRNasin 1L10mM dNTP 2L混匀，37 5min。M-MULV反转录酶 1 L置于 42水浴，1h。 70保温5min（使酶失活）。PCR产物进行1%琼脂糖电泳分析鉴

14、定。于-20保存备用。2、用克隆引物、表达引物扩增目的基因（25l体系） 在灭菌的PCR管中，依次加入：模板（反转录产物） 1l2xMix 12.5l10mM dNTP 0.5l克隆引物B1 /表达引物EB1 1l克隆引物B2 /表达引物EB2 1ldd H2O 9.5l混匀后按下面的设置程序进行扩增。94 3 min 94 45Sec 32 cycles: 55 45Sec 72 1min 72 5minPCR产物进行1%琼脂糖电泳分析鉴定。附：用克隆引物扩增一管，用表达引物扩增三管。2.5实验结果及分析 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 MarkcDNA 1 2 3

15、4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 分析：左上角的小胶以及大胶右边第二个孔均是质粒电泳图。剩下的为一个克隆引物扩增产物以及三个表达引物扩增产物。大胶：由电泳图可以观察到克隆与表达扩增产物均有一条亮带，且分子量相同。表达与克隆的差别在于表达多了酶切位点。9、10、12、15无扩增产物，可能因为模板浓度太低或者反应体系中存在抑制物或者引物被降解。14出现一条不明原因的特殊带。均拖带现象严重，而且DNA有降解左上小胶：质粒的分子量大，且为环状，所以质粒跑得最慢。左上图中的暗带为溴酚蓝。4、5条带缺失。整体上结果不错。所需目的基因的条带很亮。3 核酸琼脂糖电泳分析3.1

16、试剂 TAE缓冲液（50）：用时需稀释50倍 点样缓冲液Loading buffer（10）：0.25%溴酚蓝，40%甘油 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶。注意：EB具致癌作用。 琼脂糖3.2 器材电泳仪系统、凝胶成像系统3.3 操作步骤3.3.1 琼脂糖凝胶的制备（1%琼脂糖凝胶）称1g琼脂糖加入100ml TAE缓冲液中加热熔解。3.3.2 胶板制备将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TAE缓冲液），拔掉梳子。注意：缓冲液要高出胶面2mm。3.3.3 点样每个样品中加入1/10体积Loading buffer

17、（10），混匀后加入点样孔，避免相互污染。3.3.4 电泳接通电源，80V电压电泳1h左右，当溴酚蓝到达下沿12处时终止电泳。3.3.5 观察及照相将胶板拿出，在EB溶液中浸泡数分钟后，用凝胶成像系统照相。4 质粒提取（试剂盒法-百泰克）4.1 原理采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐，低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐，高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 4.2 设备离心机4.3 菌体培养 在LB液体培养基中接入带pGEX 4T-1质粒的菌种，在37下200rpm摇菌过夜。4.4

18、质粒提取1取1.5-4.5ml过夜培养的菌液，9000rpm离心30秒，弃上清，收集菌体，尽可能倒干上清。超过1.5ml菌液可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多菌液，重复步骤1，直到收集足够菌体。2用250ul溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋震荡至彻底悬浮。如果有未悬浮的菌块，会影响裂解，导致提纯量和浓度偏低。3加250ul溶液P2，温和地上下翻转6-10次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮。温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，若菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。4加400ul溶液P3，立即温和地上下翻转6

19、-10次，室温放置5分钟。13,000rpm离心10分钟，小心取上清。5将吸附柱置于收集管上，加入500ul溶液P4，13,000rpm离心1分钟，弃滤液。将 4步所得上清加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），13,000rpm离心1分钟，弃滤液。6、加入500ul去蛋白液PE，13,000rpm离心30-60秒，弃滤液。此步骤除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应加此步骤；如果所用菌株为XL-1Blue和DH5等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可略过此步骤。7、加入500ul漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇！），13,000rp

20、m离心30-60秒，弃滤液。8、重复步骤7一次，13,000rpm离心30-60秒，弃滤液。空柱13,000rpm离心2分钟。室温放置3-5分钟，除去残留乙醇。9、取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管仲，在吸附膜中间部位加50-100ul洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70水浴加热效果更好），室温放置1分钟，13,000rpm离心1分钟洗脱DNA，可立即用于下游分子生物学实验活-20保存。 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减小洗脱体积，但是最小体积不应少于50ul，体积过小降低质粒洗脱效率，减少产量。 注各试剂的作用：P1是使细菌沉淀完全分散，重悬，螯合金属离子

21、，使DNA酶失活。P2是高pH值的强阴离子，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒释放到上 清中。 P3是使PH值恢复到中性，DNA双链就再次形成，使核酸和蛋白沉淀。 PE去除痕量核酸酶等杂质。 WB洗去未与吸附柱特异结合的物质。 EB将DNA从吸附柱上洗下来。注意事项1、第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入45ml无水乙醇，充分混匀，打钩标记！2、第一次使用前请将RNaseA全部加入溶液PI中，混匀，每次使用后置于2-8保存。3环境温度低时P2中SDS析出， 37水浴可恢复澄清，不要剧烈摇晃形成过量泡沫。4各溶液使用后应及时盖紧盖子，长时间暴露于空气中易导致挥发、氧化、PH值

22、变化。5表达载体和目的片断的酶切5.1实验原理：限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。凝胶电泳琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法(如密度梯度离心法)所无法分离的DNA片段。

23、当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。5.2 试剂 BamH Sal BamH buffer5.3 设备电泳仪系统、紫外灯、恒温水浴箱5.4 操作步骤5.4.2 质粒DNA和目的片断的酶切目的片断来自实验2中用Pfu酶扩增和回收的PCR产物管号pGEX 4T-142l0PCR产物042lBamHBuffer（10）5l5lBamH1l1lSal2l2l按下表将各种试剂分别加入每个200l的Eppe

24、ndorf管中，要注意管号。加样后混匀，置于37水浴中，保温34h。6570保温10min灭活酶。5.4.3 酶切产物全部经琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒进行回收。凝胶成像后，戴上护目镜（眼镜/头盔）及双层手套，准备好四个EP管，称重。1. 打开灯箱，在紫外灯下用刀片切下目的条带，尽量避开无条带的凝胶2. 将切下的条带分泳道放入各个EP管，用酒精洗涤外部3. 称重，折合得到胶的重量4. 加入等体积（重量按密度为1换算成体积）的PW5. 56水浴5min，其间震荡以加速溶解6. 将上一部所得溶液加入AC柱，12000rpm*30s,弃废液7. 加入600lWB，12000rpm*1min，弃废

25、液，重复操作一次8. 将AC柱放入空管中，12000rpm*2min，彻底洗去漂洗液（弃废液，开盖使乙醇挥发完全）9. 取出AC柱，放入干净的离心管中，向膜的中间部位加入50l洗脱液，12000rpm*3min，收集液重新加入AC柱，12000rpm*3min，收集液即为载体。PS： 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减小洗脱体积，但是最小体积不应少于50ul，体积过小降低质粒洗脱效率，减少产量。目的片段cDNA分析：由图可以看出酶切结果很好，大部分酶切片段是实验所需的，有的条带很亮而有的条带暗一些是因为点样的酶切片段浓度要高一些，量大一些，所以照相时会更亮。分析：图中

26、中间较亮的条带是可以回收的，是目的基因与载体的片段，右图中亮的条带有些加宽可能是因为震动而产生的位移。6 载体和外源DNA的连接6.1实验原理：分子的体外连接就是在一定条件下，由连接酶催化两个双链片段组邻的端磷酸与端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程，分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5磷酸基团以抑制载体D

27、NA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5磷酸和相邻的3羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。6.2 试剂 目标DNA片段（PCR扩增产物） 载体（pGEX 4T-1酶切回收产物） 10ligation 缓冲液 T4 DNA连接酶 ddH2O6.3 设备台式离心机、恒温水浴、微量移液器6.4 操作步骤6.4.1 表达载体与目的片断的连接取一个200l的PCR管依次加入下列试剂：

28、pGEX 4T-1酶切回收产物： 2l酶切回收的目的基因片段： 6l10buffer： 1l T4连接酶： 1 l离心30Sec，使反应体系充分混合，4连接过夜或（16连接4h；22连接2 h）。重组质粒分析：片中间较亮的一行应该是载体和外源基因连接好的，可以说明实验比较成功，大部分都连接上，同样图中还可以发现其他的条带，可能是空载体、外源DNA、载体载体、外源DNA外源DNA等连接跑出的。7感受态细胞的制备及转化（CaCl2方法）7.1实验原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞

29、膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37培养过夜，这样即可得到转化菌落。7.2实验材料大肠杆菌DH5或BL21（DE3）73 试剂 LB培养基（液体和固体培养基配置方法参见附录2） 氨苄青霉素7.4设备培养皿、带帽试管、涂布器、冷冻离心机、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）、恒温摇床7.5 操作步骤7.4.1 感受

30、态的制备 从LB平板上挑取单克隆于5ml LB培养基中，37 200rpm摇菌1216h。 将活化过的菌按15的体积比接种到新的LB液体培养基中，37 200rpm摇菌约2h，OD600约为0.4。 取1.5ml摇好的菌液于一1.5ml的EP管中，4 4000rpm离心3min，弃上清。 加250l 0.1M CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，4 8000rpm离心1min弃上清。 加100l 0.1M的CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，即为感受态细胞。置于4 存放。12h内使用效果最佳。注 无菌操作和保持低温。 培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。 如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。7.4.2转化 将盛有感受态细胞的EP管放置于冰上10min，加入10l连接产物（若加质粒，则只需加1l），温和混匀，冰浴2030min。 42热激90S。冰浴510min。 加入1000