基因克隆题源.docx

1、基因克隆题源一、 名词解释1、 限制性核酸内切酶：简称限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中某些特定的核苷酸序列，并在该序列切割DNA双链结构的核酸内切酶。2、 同尾酶：末端是相同的限制性核酸内切酶。3、 DNA聚合酶：是指那些以DNA或RNA为模板催化合成互补新链的酶，这类没大都需要一个引物来引发DNA的聚合作用，参与DNA复制和DNA损伤的修复。4、 DNA连接酶：简称连接酶，是指在双链DNA分子单链间断处或是两条DNA片段接头位置上相邻的5P和3OH之间催化形成一个磷酸二酯键，使两个DNA片段或DNA单链间断连接起来的一种酶。5、 基因克隆技术：是包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力

2、的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达。从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。6、 载体： 要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体。7、 质粒：是细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，是一类亚细胞有机体，结构简单，没有蛋白质外壳，没有细胞外的生命周期，可以在宿主细胞内独立增殖，可以随宿主细胞的分裂而被遗传下去。8、 转化：是感受态的大肠杆菌细胞捕获和克隆或表达质粒DNA分子的基因转化方法。9、 转染：是感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的基因转化方法。10、感受态细胞：为了有效

3、地使细菌吸收外源 DNA分子，通常要对它们进行一些物理或化学处理，处理后的细胞吸收外源DNA分子的能力大大提高，这种细胞被称为感受态细胞。11、蓝白筛选：当带有氨苄青霉素的培养基中加有X-gal及一种-半乳糖苷酶的诱导物IPT是，那些能合成完整-半乳糖苷酶的未重组子就会因它能酶解X-gal而变成深蓝色，而重组子因lacz基因被破坏不能合成完整的-半乳糖苷酶而呈白色。12、融合蛋白：由一条短的多肽和真核蛋白质结合在一起的蛋白。13、开放阅读框：在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码子为止的一个连续编码序列。14、星活性：是指在非最适的反应条件下，有些酶的识别特异性会降低，表现出松弛

4、的专一性。15、基因组文库：将某种生物的全部遗传组成（DNA）切成适当长度的片段，连接在载体上，转化到宿主细胞中而构建的基因文库。16、cDNA文库：通过一系列的酶催作用，使总Poly（A）mRNA转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后再转化给大肠杆菌寄主菌株的细胞内。如此便构成了包含着所有基因编码序列的cDNA基因文库。17、目的基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的宿主细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）18、间断：在DNA的一条链上某一位置两个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂。19、粘性末端：大多数限制性核酸内切酶在DNA的两条链错开

5、24个核苷酸切断，这样产生的DNA末端会带有5突出或是3突出的DNA单链，这种末端称为粘性末端。20、质粒的不亲和性：是指没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。其基础是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。二、 填空题1.（1973年）被评定为基因工程诞生之年。而Cohen创立了基因工程的基本模型，是基因工程的创始人。（1996年）世界上第一只基于核移植技术的克隆动物“Dolly”诞生。2. DNA聚合酶的Klenow片段是用（枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶）切割DNA聚合酶得到的分子质量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：（53合成酶的活

6、性）；（35外切核酸酶）的活性。3. 切口移位法标记DNA的基本原理在于利用（DNA聚合酶）的（53外切核酸酶）和（53合成酶）的作用。4. 反转录酶除了催化DNA合成外，还具有（核酸水解酶H）的作用，可以将DNA-RNA杂种双链中的（RNA）水解掉。5. 就克隆一个基因来说，最简单的质粒载体也必须包括三分部分：（复制区）、（选择标记）、（克隆位点）。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子质量。6. pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于（pMB1），它的四环素抗性基因来自于（pSC101），它的氨苄青霉素抗性基因来自于（pSF2124或R质粒）。7. pBR322的最大容载能力是（

7、6kb），DNA的最大容载能力是（23kb）。8. 既能在E.coli又能在S.cervisiae中自我复制的载体DNA称为（穿梭载体）。9.型限制性核酸内切酶属于（复合核酸酶），既具有（内切酶的活性）又具有（甲基化酶）的活性。10. 正丁醇抽提法是用于去掉插入DNA中的（EB）。11. pUC质粒载体的复制起点来自（pBR322），还含有大肠杆菌（-半乳糖酶基因）的启动子及其编码（-肽链）的DNA序列，此结构特称为lacZ基因。12. taqDNA聚合酶具有一种（非模板依赖性）活性，这种活性可以在PCR产物的（3端）加上（一个）非配对的脱氧腺嘌呤核苷。13. 型限制性核酸内切酶一般识别（4-

8、6）个碱基，也有6个以上的，这些序列具有（双重螺旋对称）的结构形式，换言之，这些核苷酸对的序列是呈（回文）结构的。14. 通过比较不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的（限制性酶切图谱），又叫做（物理图谱）。15. 在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2s，其目的是（混合均匀）和（防止部分酶切）。16. 由于DNA是由四种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是（4n ）。17. 核酸杂交探针可分为两大类：DNA探针和RNA探针。其中DNA探针又分为（基因组DNA）探针和（cDNA）探针。1

9、8. 限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自（属名的第一个字母），第二、三两个字母取自（种名的前2个字母），第四个字母则用（菌株名）。19. 在抽提DNA的过程中加入异戊醇的目的是（起消泡的作用，并使蛋白质层紧密，使水相和有机相分层较好）。20. 在采用乙醇沉淀法进行DNA溶液的浓缩时，应该向含（一价阳离子）的DNA溶液中加入（2体积）的无水乙醇，并使温度在（-20），从而使DNA沉淀。21. 限制性核酸内切酶切割DNA常用的方法有（单酶切法）、（双酶切法）和（部分酶切）等几种。22. 利用载体的双抗药性，再次筛选真正的重组DNA分子的操作过程中需要进行（平板影

10、印），以免出现大量的假阴性或假阳性重组子现象。23. 由于RNA分子与硝酸纤维素膜结合能力相对较差，Northern印迹杂交法中采用的叠氮化的（活性滤纸或尼龙膜）。24. 具有Ampr Tets 表型的细胞所携带的pBR322，在其（Tet）基因内带有插入的外源基因。25. 经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，通过（毛细管或电导或虹吸）作用被转移到滤膜上。26. cosmid 克隆载体能克隆（40kb）左右的外源DNA片段，所以被广泛地用于构建基因组文库。27. 平末端DNA分子的连接，可以利用（T4DNA）连接酶能连接平末端分子的特性直接进行载体和目的基因的连接，实现重组。28.（转化反应

11、）是使重组DNA在热休克的短暂时间内被导入宿主细胞的过程。29.（细菌）RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。30. 从（真核）基因转录的mRNA缺乏SD序列，不能结合到核糖体蛋白上。31. DNA分子连接分为（平末端连接）、（粘性末端连接）。32.（S1核酸酶）是一种特异性单链核苷酸内切酶，能降解单链DNA和单链RNA，双链核酸分子的单链区。33.（多核苷酸激酶）可以催化ATP的磷酸基团转移至DNA或RNA的5羟基末端。34. DNA重组技术主要涉及两大核心技术：（DNA重组）和（克隆）。35. 一个完整的基因克隆过程应包括：目的基因的获取，（载体）的选择与改造，（目的基因与载体）的连接，重

12、组 DNA 分子（导入）受体细胞，（筛选）出含感兴趣基因的重组 DNA 转化细胞。 36 .限制性核酸内切酶是由（细菌）产生的一类识别 （细菌），并在识别位点切割（磷酸二酯）键的核酸内切酶。 37. 科学家感兴趣的外源基因又称（目的基因），其来源有（制备基因组文库）、（构建cDNA文库）、（PCR扩增）、（人工合成DNA技术）等几种途径。38. 常用的目的基因与载体连接的方式有（黏性末端连接）、（平头末端连接）、（人工接头法）、（同源多聚尾连接法）。 49. 根据采用的克隆载体性质不同，将重组 DNA 分子导入细菌的方法有（转化）、（转导）等。 40. Northern印迹杂交将（RNA）进行

13、变性电泳后，再转移到固相支持物上与探针杂交的一种核酸分子杂交技术，可用于检测目的基因在（转录）水平上的变化。41. 基因组文库指存在于（转化细菌或宿主细胞）内、由克隆载体所携带的（所有基因组DNA片段）的集合。基因组DNA文库涵盖了基因组全部基因信息。42. cDNA文库是指从组织细胞中分离得到纯化（mRNA）的，然后以之为模板，利用（逆转录酶）合成其互补DNA，再复制成双链片段（ cDNA ），与适当载体连接后导入受体菌内，扩增，构建cDNA文库。43. 基因组文库含有组织或细胞的（DNA)信息，cDNA文库含有组织或细胞的(mRNA）信息。44. 具有相同识别序列的限制性核酸内切酶称为（同

14、裂酶）。45. 如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生5突出的黏性末端，则可以用（Klenow酶填补的方法）进行3端标记。如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3突出的黏性末端，则可以用（T4 DNA聚合酶）进行3端标记。46. 将酵母染色体DNA的（端粒复制序列）、（自主复制序列）和（着丝粒）以及必要的选择标记克隆到大肠杆菌智力pBR322中就构建成了YAC克隆体。47. 目前常用的DNA探针标记方法有（缺口平移标记法）、（随机引物标记法）、（末端标记法）、（酶直接标记法）及（PCR反应标记法）等。48. 大肠杆菌lac操纵子由（启动子）、（操纵子）和（结构基因）三部分组成。49. 目的

15、基因起始转录后，保持（mRNA的有效延伸）、（终止及稳定存在）是外源基因有效表达的关键。50. 噬菌体基因组的中间区段约占噬菌体基因组的（40%），包括（编码基因调节）、（溶源状态的发生）、（维持)以及(遗传）重组所需要的基因。51. 可用T4DNA聚合酶进行平末端DNA标记，因为这种酶具有（53 合成酶）和（35外切核酸酶）的活性。52. 人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为（0）时吸附DNA，在温度为（42）时摄入DNA。53. 感受态的两种假说：（局部原生质化假说）；（酶受体假说）54. 基因工程的两个基本特点：（分子水平操作）；（细胞水平表达）55. 噬菌体之所以被选为基因工程的载体，主要

16、有两方面的原因：它在细菌中能够（大量繁殖），这样有利于外源DNA的扩增；对某些噬菌体如噬菌体的遗传结构和功能研究的比较清楚，其（大肠杆菌宿主系统）的遗传也研究得比较详尽56. 噬菌体的基因组DNA为（48.5）kb，有（60）多个基因。在体内，它有两种复制方式，扩增时按（凯恩斯模型）复制，成熟包装时则是按（滚环）复制。它有一个复制起点，进行（双）向复制。噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以以环状形式存在，并且能够自然成环。其主要原因是在噬菌体线性DNA分子的两端各有一个（12）个碱基组成的天然黏性末端。这种黏性末端可以自然成环。成环后的黏性末端部位就叫作（cos）位点。57. 重组体的筛选有两

17、层含义：将携带有（外源插入DNA片段）的克隆挑选出来；将携带有特定外源插入片段的（重组体）挑选出来58. Northern印记和Southern印记有两点根本的区别：印记的对象不同，（Northern印记）是RNA，（Southern印记）是DNA；电泳条件不同，（Northern印记）是变性条件，（Southern印记）是非变性条件。59. 根据外源片段提供的遗传表型筛选重组体，必须考虑三种因素：（克隆的是完整的基因）；（使用的是表达载体）；（不含内含子）。60. 噬菌斑形成选择法有两种判断标准：（能否形成噬菌斑）；（形成斑的清晰度）。三、 判断对错1. 克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁

18、殖，以及由无性繁殖形成的表现型完全相同的后代个体组成的种群。（基因型）2. 类型I限制性内切酶属于复合核酸酶，既具有内切酶的活性又具有甲基化酶的活性。3. 星活性是指某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下，60min内完全切割1mgDNA所需要的酶活性。（1ug)4. 同尾酶是指识别序列不完全相同，但切割DNA产生的末端是相同的限制性核酸内切酶。5. 大肠杆菌有细胞壁。6. pBR322质粒载体上含有氨苄青霉素抗性基因和卡纳霉素抗性基因。（四环素抗性基因）7. M13噬菌体的结构式是头尾状的。（纤维状）8. 噬菌体感染大肠杆菌后，线形DNA注入细胞内，或者进行溶菌生长途径，黏性末端连接，成为环形

19、DNA分子。9. 重组体筛选的转入阶段，DNA分子以双链的形式进入细胞。（单链）10. 蓝白筛选过程中，大肠杆菌株系修饰过的lacZ基因编码-半乳糖苷酶的N末端-肽链。（ C末端）11. Northern印迹杂交探针可用RNA也可用DNA。12. Northern印迹杂交的受体是DNA片段。（RNA）13. 开放阅读框ORF不是外显子集合。14. 开放阅读框ORF开始全是起始密码子AUG。（不全是）15. 真核生物的转录起始位点是加帽位点。16. 真核生物的翻译起始位点是起始密码子。（不是）17. 原核基因表达系统不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。18. 当通过RT-P

20、CR得到cDNA片段,利用末端转移酶将oligo(dA)加到cDNA第一链末端，通过另一个特异引物来扩增5区,这一技术称为RACE。（dT）19. 末端转移酶催化作用不需要模板。20. 将导入外缘基因DNA分子后能稳定存在的宿主细胞称为重组子。(转化子）21. 严谨型质粒通常是一些具有自身传递功能的大质粒。22. 转化过程中热击温度是37度。（42度）23. SD序列与起始密码子之间的距离为39个碱基. 24. SD序列为原核生物特有。25. 质粒提取过程中溶液I的作用是使蛋白质和DNA变性。（溶液II)26. TapDNA聚合酶具有非模板介导的核苷酸转移酶活性，可在双链DNA末端加上一个单一

21、的3突出的dATP 。27. 蓝白筛选中培养基涂布的IPTG是乳糖类似物。（-半乳糖苷酶的诱导物）28. 限制性内切酶型酶的识别与切割顺序全是呈回文结构。29. DNA的浓缩中，在含一价阳离子的DNA溶液中加入1体积的无水乙醇，使DNA沉淀。（2倍体积）30.不对称PCR是指PCR反应体系中引物的浓度不对称。四、 简答题1.影响核酸限制性内切酶活性的因素答：（1）DNA纯度：纯度越高，酶切效果越好； （2）DNA甲基化程度：甲基化的碱基将不能被酶切，所以要降低甲基化程度； （3）酶切消化反应的温度：温度要在酶的最适反应温度； （4）DNA的分子结构：切割超螺旋DNA的酶量比线性DNA高出许多倍

22、； （5）缓冲液：pH和离子浓度对酶切效果也有显著影响。2.作为一个载体需要那些性质答：（1）能在宿主细胞独立地自我复制与表达； （2）分子量应较小； （3）应具有两个以上的容易检测的遗传标记； （4）应具有位于遗传标记基因内的多个酶切单一位点。3.简述pBR322质粒载体的优点答：（1）具有较小的分子量； （2）具有Amp和Tet两种抗性基因可供作转化子的选择记号； （3）具有较高的拷贝数。4.简述pUC质粒载体的优点答：（1）具有很小的分子量 （2）具有很高的拷贝数 （3）可用组织化学法检测重组体，如蓝白筛选，简单方便 （4）具有多克隆位点5.简述噬菌体的生长途径答：噬菌体感染大肠杆菌之后

23、，线性DNA注入细胞内， （1）进入溶菌生长途径： 形成环形DNA分子，合成蛋白质，复制DNA，包装成子代噬菌体颗粒，并使宿主细胞破裂，释放噬菌体感染新细胞。 （2）进入溶源生长途径： DNA整合到宿主细胞染色体上，随着染色体的复制而复制。只有在一定条件下，DNA才会脱离染色体，重新进入溶菌生长途径。6.阐述受体细胞形成感受态的机制的假说答：（1）局部原生质体化假说 即局部失去了细胞壁结构或局部溶解细胞壁，使外源DNA分子能通过质膜进入细胞 （2）酶受体假说 感受态细胞表面形成一种能接受DNA的酶切位点，使DNA分子能进入细胞。7.简述重组DNA转化过程答：（1）吸附阶段：完整的双链DNA分子

24、吸附于感受态细胞的表面； （2）转入阶段：双链DNA解链，以单链的形式进入细胞，另一链被降解； （3）自身稳定阶段：外源质粒在细胞内又复制成双链环状DNA； （4）表达阶段：目的基因随质粒一起复制，并转录翻译。8.简述原核生物转录的过程答：（1）RNA聚合酶亚基发现启动子序列与-35区结合，并进一步与-10区结合；（2）DNA解链，模板被暴露；（3）因子识别并起始启动位点，开始转录；（4）因子解离，RNA聚合酶继续转录向前移动；（5）转录终止。9.制约目的基因表达的因素有哪些答：（1）外源基因是否插入在正确的阅读框； （2）目的基因的有效转录，如启动子的作用； （3）mRNA的有效翻译，如SD

25、序列的作用； （4）转录后，翻译后的适当修饰和加工过程。10.翻译过程对表达有哪些影响答：（1）SD序列与rRNA的16s亚基3末端序列之间的互补程度； （2）起始密码子AUG与SD序列之间的距离以及SD序列的核苷酸组成； （3）起始密码子之后的一个核苷酸对mRNA与核糖体的结合也有影响； （4）基因末端转录终止区的影响。11.真核基因在原核基因中表达的困难及解决办法答：（1）细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子；所以载体上的启动子要用原核细胞的启动子。 （2）从真核基因转录的mRNA缺乏SD序列，不能结合到核糖体蛋白上；所以要在载体上加上SD序列。 （3）原核细胞没有转录后修饰系统，真核

26、基因mRNA的内含子不能被切除，以致不能表达成蛋白；所以应从真核细胞中分离mRNA并反转录成cDNA来导入载体。 （4）真核基因表达的蛋白在原核细胞中不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏；所以应将真核基因插在几个原核密码之后，这样，翻译表达出来的真核基因产物就与原核多肽连在一起，形成融合蛋白而不会被降解。12请简述碱裂解法提取质粒的原理。答案：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性甚至出现断裂，因此，当溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅

27、速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则交缠成网状难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清液中。13在连接过程中，如何提高平末端的连接效率？答案：1.增加连接酶的用量，通常是粘性末端连接酶用量的10倍。2.增加DNA平末端的浓度，提高平末端之间的碰撞几率。3.适当提高连接反应的温度，平末端连接与退火无关，适当提高反应温度既可以提高底物末端或分子之间的碰撞几率，又可增加连接酶的反应活性，一般选择20-25C适合。4.还可延长反应时间。14将目的片段重组后转入到受体细胞中时，共有哪几种可能进入到受体的DNA 分子？答案：1.未连接上的载体分子

28、 2.未连接上载体的DNA片段 3.目的DNA和载体连接上的期望的重组DNA 4.自身环化的载体分子 5.连接污染DNA片段的重组DNA15在对重组体的筛选中，电泳筛选法中有哪两种方法？什么时候用第一种方法？什么时候用第二种方法？这两种方法各有什么特点？答案：直接提质粒跑电泳及用酶切下的目的片段跑电泳两种方法。 （1）直接提质粒跑电泳的方法：在目的片段比较大的时候用此方法。此时所用的Marker较大，因此精确度不高，由于片段较长，所用的胶浓度小。 （2）酶切后的目的片段跑电泳：在目的片段比较小的时候用此方法。此时所用的Marker较小，因此精确度较高，由于片段较短，所用的胶浓度大。16若想将一

29、段真核生物的基因在原核生物中表达,哪些结构是一定必须的，此外在表达载体上还需哪些结构才能使基因顺利表达？答案：至少需要外显子的全部序列之和。若这段序列不含起始密码子或终止密码子，则都得在表达载体上加上。此外，这个载体还需要一个启动子，SD序列及终止子。五、 问答题1、 实验得到一原核基因，想要通过发酵获得大量基因表达产物应选哪种表达系统？为了使目的基因高效表达应注意哪些问题？基因表达产物又应该如何分离纯化？答：原核表达系统。1）外源基因是否插入在正确的阅读框架2）目的基因的有效转录（如启动子的作用）3）mRNA的有效翻译（如SD序列等作用）4）转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程 细胞破碎离心

30、-沉淀法-超滤、浓缩法分离特异表达蛋白-进一步分离柱层析-聚丙烯凝胶电泳2、 我们知道要实现外源目的基因的克隆，除了选择理想的载体，合适的受体及成功的构建重组体外，还必须选择合适的方法将重组DNA导入宿主细胞。简要列举几种将重组DNA导入宿主细胞的方法；选择适合的方法可以有效的提高转化率，转化率是转化效率的评估指标，请问，当我们用1ng 1kb DNA进行转化处理，如果得到100个转化子，那么计算该重组DNA的转化效率是多少？（已知：1ng 10kb DNA的分子数为1108个）解：1）将重组DNA导入宿主细胞的方法目前主要有：转化、转染、 显微注射技术、电转化法、基因枪法、脂质体介导法、花粉

31、管通道法等。2）已知1ng 10 kb DNA的分子数为1108个，则1ng1kb DNA 的分子数为1109个，那么转化率为1001109=10-73、 实验中有哪些方法筛选出含有DNA重组体的宿主细菌？答案：直接筛选法：1）药物抗性检测：用于细菌, 真菌, 植物和动物细胞的各种抗生素抗性基因-若克隆载体携带某种抗菌性标志基因，转化后只有含这种抗菌基因的子细菌，才能在含该抗生素的培养板上形成菌落；2）标志补救：转化或转染的外源基因表达产物可弥补基因缺陷性宿主菌的性状；3）分子杂交：对于整合型载体, 则应该利用DNA杂交或RNA杂交法证实：用 探针与DNA克隆片段进行杂交，直接选择鉴定。免疫学方法：利用特异抗体，与目的基因表达产物作用，进行筛选，包括免疫化学和酶免疫检测分析。鉴定目的基因的特异表达产物，特异性强、灵敏度高，适用于筛选无任何选择标记的基因4、在植物某基因编码区的全长获得时，某人仅有此基因的EST，且现在所有的数据库中并没有此基因的全长序列，现在他想要获得此基因编