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1、暨南大学分子生物学资料暨南大学 2005 分子生物学复习题参考解答1. 举例解释蛋白质二级结构、超二级结构（MOTIF）、三级结构、DOMAIN和四级结构？二级结构:一条多肽链主链原子局部的空间排列超二级结构:由若干个相邻的二级结构元件组合在一起,彼此相互作用形成的有规则的二级结构的组合体.（结构域）:多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成的三级结构的局部折叠区,是相对独立的紧密球状实体.三级结构:一条肽链的所有原子的空间排列.MOTIF:就是在许多转录因子的序列中,存在的负责与DNA结合的共同基序.这些基序通常都很短,仅含一小部分蛋白质结构,还通过与转录复合体的蛋白质之间的相互作用激活转录

2、.如锌指基序,亮氨酸拉链等都是MOTIF.四级结构:几个亚基在三级结构的基础上相互作用所形成的空间结构2.定义chaperone，并解释其功能？Chaperone:即分子伴侣，为一类与其他蛋白不稳定构像相结合并使之稳定的蛋白，他们通过控制结合和释放来帮助被结合多肽在体内的折叠、组装、转运或降解等。分子伴侣在蛋白质的折叠和组装中起非常重要的作用，它是细胞内蛋白质折叠和组装的重要调节者。分子伴侣的功能：分子伴侣是一类蛋白家族，可以在细胞内帮助蛋白折叠 在蛋白转运的过程中，保持蛋白质的去折叠状态 在受胁迫的细胞内帮助蛋白进行正确的折叠 阻止形成错误的折叠，抑制聚沉 为执行校验功能进行再折叠 为了防止

3、降解使蛋白去折叠，或选择蛋白使其降解3.分析你所认识的RNA分子二级结构？核酸分子的二级结构，对RNA而言，是指单链RNA分子通过自身碱基的配对，折叠而成的螺旋，突环相间排列的结构。如广泛存在的tRNA的三叶草形二级结构是由于小片断互补碱基配对而形成。它包括四条根据结构或已知功能命名的手臂即受体臂，D臂，反密码臂和TC臂。另外还有一条易变的多余臂。无法配对的碱基形成套索状结构。4.解释DNA聚合酶I的三种酶活性？DNA聚合酶I其活性主要有：53聚合酶活性，即使脱氧核糖核苷酸逐个加到3OH末端的核苷酸链上，使DNA链沿53方向延长，其聚合活性只能在已有的核苷酸链上延长DNA而不能从无到有开始DN

4、A链的合成；35核酸外切酶活性，只作用于单链DNA,此活性对DNA复制的忠实性极为重要，在极少情况下，聚合酶在3OH末端加上1个与模板链上碱基不配对的碱基，此时聚合酶I即可发现并切除这个错配碱基，从而避免复制过程中的错误；53核酸外切酶活性，它只作用于双链DNA的碱基配对部分，从5末端水解下核苷酸，此活性在切除由紫外线照射而形成的胸腺嘧啶二聚体中起重要作用，在DNA复制中冈崎片段5端RNA引物的切除也靠此酶。5.解释DNA聚合酶III各亚基的功能？DNA聚合酶III是多亚基组成的蛋白质,它在细胞中含量很少,在每个细胞中只有1020个拷贝的全酶，Pol III全酶由,10种不同的亚基组成核心酶由

5、, ，组成。亚基具有53方向合成DNA的催化活性,每秒可以合成8个核苷酸。亚基具有35外切核酸酶的校对功能,在体内其基本功能是控制复制的忠实性,亚基常与亚基形成一个紧密的1:l复合物,协同发挥功能.亚基使核心酶相互连接亚基使核心酶形成二聚体，与模板连接，具有ATP活性。亚基是以二聚体的形式存在的.在复制过程中二聚体环绕着DNA,并能在DNA上自由滑动,构成一个滑动钳.滑动钳可把全酶束缚在模板DNA上,从而保证高度的进行性和聚合反应速度。复合物是滑动钳的载体,可帮助滑动钳结合到DNA上. 复合物含有5个不同的亚基,形成一种化学计量为21111的结构. 二聚体自己并不能组装到DNA 上 ,它是通过

6、复合物与ATP协同作用催化ATP的水解而组装到DNA上的.6.生物如何控制一个世代只复制一次？原核生物与真核生物控制自身DNA复制次数的机理是不一样的现分别以大肠杆菌和酵母为例加以阐明：在大肠杆菌复制起点存在一些被Dam甲基化酶甲基化的位点，包括那些DnaA特异的13bp结合位点，复制起时候再复制周期后将保持甲基化状态，并处予隔离状态约10分钟，在这一时期他与膜相连，而复制的再次起始会被抑制直到复制起点完全甲基化时与膜连接的DnaA取代抹上的抑制剂时DNA才开始下一次的复制 细胞分裂后，真核生物细胞和含有执照因子，它是复制起时所需的，在酵母中执照因子在复制起始后被破坏，这就能阻止再次复制周期的

7、发生，执照因子不能从细胞只运送到细胞核中，只能在有丝分裂过程中和崩裂时才能进入核内7.阐明Rolling Circle Replication？滚环式复制(rolling circle replication)是噬菌体中常见的DNA复制方式。滚环式复制的一个特点是以一条环状单链DNA为模板，进行新的DNA环状分子合成。噬菌体的双链DNA环状分子先在一条单链的复制起点上产生一个切口，然后以另一条单链为模板不断地合成新的单链。释放出的新合成的单链或是先复制成双链DNA，被酶切割成单位长度后，再形成环状双链DNA分子；或是释放出的新合成的单链DNA，先被酶切割成单位长度形成单链环状DNA分子后再复制

8、成双链环状DNA分子。 质粒的滚环式复制有2个步骤：第一步是前导链的合成。质粒编码的复制蛋白（Rep）起始子与超螺旋DNA的正起点结合，并提供链特异性及位点特异性缺口。随着缺口的母链被替换，随着宿主编码的产的参入，前导链的合成不断进行着，当复制复合体到达重构的起点，同一个或另一个Rep分子在质粒DNA上引入一个新的缺口，使替换链从ssDNA形式解放；第二步是随后链的合成。这一过程从不同的质粒区域即单链起点起始。由于前导链和随后链的解偶联，复制是不对称的。ssDNA的产生是RC质粒的标志。宿主谱广可能是RC质粒的特征。8.阐述端粒的结构和端粒酶功能？端粒的结构：端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构

9、，是由端粒DNA和与端粒DNA特异结合的端粒结合蛋白组成的核糖核酸的蛋白质复合物，在真核生物包括原虫、真菌、纤毛虫、植物和哺乳动物中都存在端粒DNA 由非编码的重复序列组成，不同物种的DNA 重复序列的重复数不同，如人与其他脊椎动物约为2 000 个，拟南芥是53 个拷贝不同的真核细胞端粒存在类似的DNA 序列与结构，且高度保守。其共同的特征是富含G，而且富含G的链(53)比富含C的链(35)突出1216个核苷酸。尽管端粒DNA 是染色体末端的一个结构，但在染色体的中间也发现了同样的重复序列与端粒DNA 相邻的是一“端粒下区”(subtelomericregion)，它由一些退化的端粒DNA

10、片断独特的重复片断组成。端粒除简单的核苷酸重复外，还包含有特殊的非核小体蛋白端粒结合蛋白端粒结合蛋白依据结合特性分为两大类 (1) 双链TBPs (double-strand TBPs)：这是一类可特异地与双链端粒重复序列结合的蛋白质，它在端粒长度的维持中具有重要作用，而且对端粒具有保护和调节功能。 (2) 单链TBPs(single-strand TBPs)：可结合于3单链突出的末端，对于染色体末端的“戴帽”，以及端粒酶活性的调节具重要作用。端粒酶的功能：端粒酶的主要作用是维持端粒的长度。端粒酶不但可以维持已经存在的端粒DNA，同时端粒酶反转录酶能够识别断裂染色体的末端，重新将端粒重复序列加

11、到染色体的断裂末端或非端粒DNA上。端粒酶能利用端粒3端单链为引物，自身的RNA 为模板合成端粒重复序列添加到染色体末端，从而延长端粒的长度。人的生殖细胞、造血干细胞及T，B 淋巴细胞中端粒酶有不同程度的表达，而在正常的体细胞中，端粒酶处于失活状态，因此体细胞随细胞分裂次数的增加端粒逐渐缩短。端粒的长度与有丝分裂次数相关，所以端粒又有细胞的“有丝分裂钟”之称。9.描述The Nucleotide Excision Repair pathway。 当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，则需要以核苷酸切除修复(nucleotide-excision repair)方式进行

12、修复。1）切除损伤部位。一种专门的核酸切割酶识别并在已损伤的核苷酸5和3位分别切开磷酸糖苷键，产生一个由1213个核苷酸（原核生物）或2729个核苷酸（人类或其他高等真核生物）的小片段。2）DNA解链酶把切除的小片段核苷酸移去。3）DNA聚合酶I（原核）或DNA聚合酶E以完整的互补链为模板，按53方向DNA链，填补已切除的空隙。4）DNA连接酶封口，修复完成。10.解释recA, recB, recC ，recD ，RuvA，RuvB，RuvC genes 所编码蛋白和Chi sites 在重组中的作用。RceA蛋白具有链交换，ATP酶及蛋白酶活性。它能结合到ssDNA上，促使DNA分子间的链

13、交换，我们将RecA催化单、双链DNA的反应分为三个阶段：1 RecA结合到单链DNA上。2 单链DNA与其互补物在双链上快速配对反应，产生异性双链连接3 单链从双链中转移，取代了双链中的一条链。RecBCD是由recB，recC，recD三个基因编码的三个亚单位组成的酶，具有：核酸外切酶V活性；解旋酶；核酸内切酶；ATP酶；ssDNA外切酶活性。它能结合到双链的上并使双链解旋并分开，当遇到Chi位点时，RecBCD就切开一条单链，并失去RecD亚单位，RecBC继续解开双链。这样就得到了链交换和重组的位点。Chi是一个被recBCD基因编码的酶的作用目标。 RuvA辨认Holliday连合处

14、的结构，RuvB是一个解旋酶，并以六聚体形式结合于双链DNA上，解开双链螺旋。ruvC，编码了一个末端核酸酶，它能确精地辨认出Holliday结合处，结合到Holliday中间产物上，将这样的结合处分开。11.原核生物启动子所组成的保守序列和终止子特异序列是什么？原核生物中绝大部分的启动子都存在位于-10bp处的TATAAT区和-35bp处的TTGACA区。这两个区是相当保守的序列，是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与因子相互识别而具有很高的亲和力。在-35区和-10区之间的距离171bp。保持启动子这二段的序列以及它们之间的距离是很重要的，否则会改变它所控制的基因的表达水平。UP 元件，位

15、于启动子上游-57 和 -47 富含A/T 。(5-AAAATTATTTT-3).不依赖于rho因子的终止子：终止位点上游一般都存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构。在终止位点前面有一段由6-8个A组成的序列，所以转录产物的3端为寡聚U，这种结构特征的存在决定了转录的终止。依赖于rho因子的终止子：依赖rho因子的转录终止区DNA序列缺乏共性。Rho因子是一个相对分子量为2.0105的六聚体蛋白，是一种NTP酶，通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。RNA合成起始以后，rho因子即吸附在新生的RNA链上，靠AT

16、P水解产生的能量，沿53方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3-OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，使之从模板DNA上释放mRNA ，完成转录过程12. RNA聚合酶I识别的启动子包含有哪两个部分？分别有什么蛋白因子识别？RNA聚合酶只转录编码核糖体RNA的基因，转录产物经切割和加工后生成各种成熟rRNARNA 聚合酶I 的转录单位有两段起始调控序列，核心启动子(Core promoter)和与之相距70bp 处的上游启动元件upstream promoter element(UPE) （旧称上游控制元件(Upstream control element，UCE)）核心启动子(Cor

17、e promoter)位于起始位点周围，从-45 延伸到+20，它本身就足以起始转录。但是，其效率可被位于-180 到-107 的上游启动元件（UPE)显著提高。与一般启动子相比，这两个区域都有不寻常的组成，富含GC碱基对，而且它们约有85%是一致的。RNA 聚合酶需要UBF1和SL1两个辅助因子。UBF1 是一个单链多肽，它先后与UPE和核心启动子上富含GC 区结合。SL1 因子是一个四聚体蛋白，其作用类似于细菌，本身对于启动子没有特异性，但一旦UBF1 结合，SL1 就可以协同UPE结合到此覆盖的DNA 延伸区域，可能其主要功能是使RNA 聚合酶正确的定位在起始位点。发生在两个部位的结合因

18、子之间相互作用的详细情况尚不清楚。两个因子都结合后， RNA 聚合酶就与核心启动子结合起始转录。简单答案：（RNA聚合酶I识别的启动子包含-40+50的近启动子和-165-40的远启动子两部分。近启动子功能决定了转录起始的精确位置，远启动子的功能是影响转录的频率。近启动子有辅助因子UBFl识别，远启动子有SL1识别。）13.RNA聚合酶III识别的启动子有哪几类？其定位因子是什么？RNA聚合酶的启动子分成两大类,由不同的因子采用不同方式识别。5SrRNA和tRNA基因的启动子是内部（internal）启动子，它们位于起点下游（Downstream）。snRNA（核小RNA）基因的启动子与其它启

19、动子相似，位于起始位点上游（Upstream）。在这两种情况中，启动子的功能元件都是由可被转录因子识别的序列组成，但它反过来指导RNA聚合酶结合。5SrRN转录产物的启动子位于基因+55和+80之间。RNA聚合酶有三种类型启动子包括两种类型的内部启动子，每个都含有两个分开的结构，其中两个短序列元件被一个多变的序列分开。类型（5SrRN）同boxA 序列和一个隔开的boxC组成，类型（tRNA）由boxA和一个隔开的boxB序列组成。类型启动子上的A盒和B盒之间的距离可以变化很大，但两盒不能过近，太近会失去其功能。RNA聚合酶的第类启动子有三个上游元件。负责转录snRNA的基因，其元件主要包括：

20、Oct-PSE-TATA(PSE：近端序列元件，提高转录效率)有关的转录因子包括TFA 、TFB、 TFC, 在类启动子的转录起始过程中，首先TFA结合于内部部启动子的boxA，然后TFC结合于boxC然后招募真正的起始因子TFB，TFB最后招募RNA聚合酶。在类启动子的转录起始过程中，首先TFC结合于平boxA和boxB，然后招募真正的起始因子TFB，后者招募RNA聚合酶。（TFB含TBP是真正的转录因子，A、C可被高盐除掉，是装配因子）14.RNA聚合酶II识别的启动子含有多种顺式作用因子，请举4例。eg1: TATA box通常位于起始位点上游约25bp处，它组成唯一的上游启动子元件，此

21、元件距起始位点有相对固定的位置。它可以在所有真核生物中找到。TATA盒倾向于被富含G*C对的序列环绕，可能是TATA盒起作用的一个因子。具有选择定位转录点的功能，作为定位因子起作用的eg2: GC box通常在起始位点上游40-70处，但在每一个启动子中，GC盒前后的情况是不一样的。功能是加强转录，两个方向都有效。eg3: CAAT box决定了转录的效率，两个方向都有效。eg4: 八聚体（8bp元件）能增强真核生物启动子的转录功能。15.列出能在真核生物细胞中表达载体的构件名称，并作出解释？真核表达系统中根据受体细胞的不同，其所应用的载体和表达策略各有不同，据此可将真核生物表达系统分为三类：

22、1酵母表达系统，2哺乳动物表达系统，3昆虫表达系统，这三类的组成元件分述如下。1.酵母表达系统的组成元件包括 1 遗传标记：利于重组子的筛选、鉴定2 调控序列a. ARS：酵母自主复制序列，相当于复制起点，可启动基因在酵母中的复制b. 2质粒，酵母细胞中存在削夺不同类型的内源性质粒，其中一种称为2质粒，它以高拷贝数存在于细胞核外，为小球状DNA，长约2m，可以独立复制转录c. 酵母启动子：在小母表达载体中必需含有酵母启动子，以启动外源基因在酵母中的表达d. 酵母着丝粒区段：增加转化的的稳定性2.哺乳动物细胞表达载体的主要组成元件1启动子2增强子，3筛选标记，4终止信号和多聚腺苷酸化信号：维系转

23、录后能有效切割和多聚腺苷酸化，在真核表达载体中须含有转录终止信号和多聚腺苷酸化信号，5剪切信号，并非所有的cDNA都需要剪切信号但一般来说内含子不会降低而是提高表达的效率，6复制元件：可提高外源基因的表达水平，7为了能方便化的大量重组DNA，哺乳动物表达载体通常含有一段原核系列。-3.昆虫杆状病毒载体转移载体的基本元件1原核系列：包括复制起始点、抗性基因及多克隆位点。2杆状病毒启动子：常用的有P10启动子 3杆状病毒复制非必需区：多采用多角体蛋白侧翼序列，提供转移载体与杆状病毒细胞内同源重组的位点昆虫细胞加尾信号16.请阐述ALTERNATIVE SPLICING的生理学意义。选择性剪接（AL

24、TERNATIVE SPLICING）是指同一基因转录形成的初级RNA经过不同的剪切和连接方式形成不同的RNA的过程。真核生物含有限数目的基因，但是当严格需要时，真核生物通过一系列精确的工具来加工 mRNA,产生不同的转录类型。选择性剪接属于复杂性剪接，也就是说，一个基因的初始转录物能够加工产生出不同的 mRNA,从而产生不止一种蛋白质。一个选择性剪接的例子就是SV40,当它感染细胞时，引导2种蛋白质的合成：大T抗原和小T抗原。这两种蛋白质表达自同一种前体mRNA，通过2个5剪切位点及一个共同的3剪切位点的不同加工过程，表达出2种不同的抗原。一般地，真核生物一个基因的外显子和内含子的数目及所在

25、位置是固定的。但也可能出现外显子和内含子数目及所在位置不固定的情况，选择性剪接的直接后果是一个基因产生多个不同功能的蛋白质。mRNA 选择性剪接涉及生命现象的很多方面，如细胞分化，个体发育，免疫机理，某些遗传病的发生等等。选择性剪接在器官发育中具有重要意义，同样的基因产生不同的蛋白质，使得不同的组织，不同的器官各自分工，形成真核生物复杂的生命体。同时可以节省大量的遗传信息。选择性剪接使真核生物在蛋白质组水平上表现出极高的复杂性，这就是人类的基因数目只有3 万多个，却有比其他生物高得多的进化程度的一个重要原因。17.请阐述RIBOZYME的应用？（由于17、18题目相对开放灵活，没有大篇幅详细解

26、答。请各位同学结合自己研究方向对感兴趣的某一方面进行详细阐述，这里只起抛砖引玉作用。）核酶(ribozyme)是一类具有催化活性的RNA 分子,可通过碱基配对特异地与相应的RNA 底物结合,并在特定的位点切割底物RNA 分子。自美国科学家Cech 和Altman 等发现核酶至今的20多年来,人们利用核酶可以特异性地切割靶RNA序列的特点,通过设计合适的核酶阻断特定基因的表达,已相继对获得性免疫缺陷综合征、肿瘤、生殖系统疾病、病毒性肝炎、白血病、移植排斥反应等进行了广泛深入的研究。核酶的种类很多，从结构上看主要有发夹状核酶(hairpin ribozyme)和锤头状核酶(hammerhead r

27、ibozyme)。从目前来看，核酶的应用主要在基因治疗上。即将核酶基因导入细胞内，使其在细胞内表达出相应的核酶，从而对mRNA进行切割，在翻译水平阻止某些基因的异常表达，达到治疗疾病的目的。核酶的应用举例：1核酶在肿瘤治疗中的应用主要集中在以下几个方面核酶与癌基因：核酶独特的切割目的基因的方式有可能阻断癌基因的表达, 从而逆转肿瘤细胞恶性增殖, 并诱导其分化和凋亡。核酶与多药耐药性：多药耐药性(Multidrug resistance, MDR) 是肿瘤化疗失败的主要原因。设计核酶抑制耐药相关基因的表达，使耐药的肿瘤细胞重新获得对化疗药物的敏感性。核酶和端粒酶：在高等生物细胞中, 除了精原细胞

28、和少数造血细胞存在端粒酶活性外, 其余体细胞的端粒酶均处于失活状态。而当细胞恶变时, 端粒酶则被激活, 使端粒酶长度不随细胞分裂而丢失, 从而使细胞逃避老化死亡, 保持无限复制与增殖。现在, 人们已经开始应用核酶技术通过抑制端粒酶活性, 从而抑制肿瘤细胞的增殖。2核酶在抗病毒中的应用抗艾滋病病毒HIV：HIV的长末端重复序列(LTR)参与病毒蛋白生成的调节，起着类似“开关”的作用。HIV感染人体后，病毒的RNA在逆转录酶作用下合成DNA，然后整合到细胞染色体上，可长期潜伏。只有某些特定的激活因子作用于已整合人细胞基因的 HIV 前病毒LTR时，才能启动表达，或使表达从低水平转入高水平。利用特异

29、性核酶在细胞内抑制HIV-1的LTR mRNA表达，能明显降低细胞HIV-1病毒蛋白的表达水平，从而达到抑制病毒复制的作用。抗乙肝病毒HBV：核酶能特异地切割HBV前基因组RNA , 使其丧失模板活性, 如针对HBcAg mRNA 设计的核酶, 可有限的剪切HBV mRNA; 针对HBV 前C/C区基因设计的锤头状核酶, 经体外转录后可定点切割靶RNA等。从而起到抗病毒的作用。尽管核酶已经开始应用于人体内治疗,但尚有许多问题有待解决。例如:如何获得高效、无毒的特异性核酶,如何选择靶序列中最佳切割位点,如何提高核酶进入靶细胞的效率并稳定发挥作用等。18.请阐述RNA分子功能的研究进展？RNA是由

30、4种核糖核苷酸组成的多核苷酸分子，在细胞内的RNA按结构与功能可分为若干类，最基础的是mRNA、rRNA、tRNA。此外还有一些小RNA分子。RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架。但长久以来，RNA分子一直被认为是小角色。它从DNA那儿获得自己的顺序，然后将遗传信息转化成蛋白质。然而，一系列发现表明，RNA事实上操纵着许多细胞功能。它可透过互补序列的结合反作用于DNA，从而关闭或调节基因的表达。甚至某些小分子RNA可以透过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。近年来对RNA分子功能的研究主要集中在以下几个方面1小干涉RNA(small interfering

31、 RNA, siRNA)双股RNA(dsRNA)对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)。双股RNA(dsRNA)经酶切后会形成很多小片段，如siRNA。siRNA一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补合，会导致mRNA失去功能，即不能转译产生蛋白质，也就是使基因“沉默化”了。2小RNA (microRNA, miRNA)最近几年来，科学家在线虫(C. elegans)中相继发现了能时序性调控发育的基因lin-4和let-7，将这类基因编码的能时序调控发育进程，长度约为22个核苷酸的小分子RNA称为small temporal RNA(stRNA)。后来，科学家又相继在线虫、果蝇、鼠、人等生物中发现了许多类似的基因，把它统称作miRNA(microRNA)。miRNA的主要功能是调节内源基因的表达，参与细胞周期的调控及个体发育过程，同时它与在siRNA具有很大的相关性，可能对基因功能研究、人类疾病防治及生物进化探索有重要的意义。此外，2004年Tomoko Kuwabara和他的同事们发现一种小dsRNA能够作用于神经基因的表达，并且能在转录水平上直接诱导神经干细胞向神经细胞分化. 这种RNA在基因转录水平上直接参与调控，它被命名为smRNA。