赤芍总苷的提取纯化与质量检查设计方案.docx

1、赤芍总苷的提取纯化与质量检查设计方案赤芍总苷的提取纯化与质量检查设计方案一、项目概述1.新药概述一类 未在国内外上市销售的药品：（1）通过合成或者半合成的方法制得的原料药及其制剂；（2）天然物质中提取或者通过发酵提取的新的有效单体及其制剂；（3）用拆分或者合成等方法制得的已知药物中的光学异构体及其制剂；（4）由已上市销售的多组份药物制备为较少组份的药物；（5）新的复方制剂；（6）已在国内上市销售的制剂增加国内外均未批准的新适应症。二类 改变给药途径且尚未在国内外上市销售的制剂。三类 已在国外上市销售但尚未在国内上市销售的药品：（1）已在国外上市销售的制剂及其原料药，和/或改变该制剂的剂型，但不

2、改变给药途径的制剂；（2）已在国外上市销售的复方制剂，和/或改变该制剂的剂型，但不改变给药途径的制剂；（3）改变给药途径并已在国外上市销售的制剂；（4）国内上市销售的制剂增加已在国外批准的新适应症。四类 改变已上市销售盐类药物的酸根、碱基（或者金属元素），但不改变其药理作用的原料药及其制剂。五类 改变国内已上市销售药品的剂型，但不改变给药途径的制剂。六类 已有国家药品标准的原料药或者制剂。2.新药申报要求2.1综述资料资料编号1、药品名称。资料编号2、证明性文件。资料编号3、立题目的与依据。资料编号4、对主要研究结果的总结及评价。资料编号5、药品说明书样稿、起草说明及最新参考文献。资料编号6、

3、包装、标签设计样稿。2.2药学研究资料资料编号15、药品标准草案及起草说明，并提供药品标准物质及有关资料。资料编号16、样品检验报告书。资料编号17、药物稳定性研究的试验资料及文献资料。2.3临床试验资料资料编号29、临床试验资料综述。资料编号30、临床试验计划与方案。资料编号31、临床研究者手册。资料编号32、知情同意书样稿、伦理委员会批准件。资料编号33、临床试验报告。以上申报材料具体要求详见药品注册管理办法附件一。3.赤芍的现代研究进展3.1赤芍的学成分和药理作用研究进展现代研究表明，赤芍包含萜类及其苷、黄酮类及其苷、挥发油类等多种化学成分，具有保肝、抗肿瘤、神经保护、心脏保护、抗血栓、

4、抗氧化、抗内毒素等多种药理作用，其对心血管系统、神经系统及血液系统等均有良好的临床治疗效果，尤以重用赤芍治疗瘀胆型肝炎及重度黄疸型肝炎为特效。采用不同极性的提取溶剂可提取不同极性的化学成分，赤芍的主要化学成分为极性或半极性，所以目前提取溶剂主要为蒸馏水、不同体积分数的乙醇、丙酮等。研究赤芍中的化学成分则主要采用高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱（TLC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、超高液相色谱-二极管阵列检测器-四极杆飞行时间串联质谱联用（UPLC-PDA-QTOFMS）、指纹图谱等。赤芍含有多种化学成分，主要包括萜类及其苷、黄酮及其苷、鞣质类、挥发油类、酚酸及其苷等，此外还有多糖

5、类、醇类、酚类、生物碱、微量元素等成分。赤芍具有多种药理作用，如保肝作用、抗肿瘤、对神经系统和心脏的保护作用、抗凝、抗血栓、抗氧化、抗内毒素等。对于赤芍药理作用及其机制的研究主要集中于TPG。3.2赤芍总苷背景意义在药理学上，赤芍总苷对血液具有抗凝血、抗血栓以及抗内毒素和改善微循环的作用。并且赤芍总苷对缺血性损伤如心肌缺血同样具有保护作用，正是这样的良好使用疗效，我们需要对赤芍总苷进行更多的研究，来保证临床的使用疗效。3.3提取研究现状目前报道的赤芍总苷提取工艺文献中，多采用正交试验设计法。即分别称取赤芍药材若干（通常800g），以不同的提取液（水、乙醇）分别按正交试验设计表试验，滤过，合并滤

6、液，量取体积，即得正交试验各试验的提取液。3.4纯化研究现状目前报道的赤芍总苷纯化工艺文献中，多采用正丁醇萃取法和大孔树脂吸附法。即将提取过程中，包括糖类、脂类等许多杂质在内的浸膏提取液，补充蒸馏水至药材的2倍量，作为待纯化样品溶液。纯化方法1（正丁醇萃取法）：取上述待纯化样品溶液200ml，取等量石油醚萃取3次，除去石油醚层，然后用水饱和后的正丁醇萃取3次，收集正丁醇层，再用200ml蒸馏水洗1次，弃去水层，减压回收正丁醇，所得浸膏于真空干燥器中干燥。纯化方法2（大孔树脂吸附法）：D101大孔吸附树脂100g，经95%乙醇浸泡12h，充分溶胀后装柱，蒸馏水洗至无醇味，备用。上述待纯化样品溶液

7、取200ml，上树脂柱，3倍量蒸馏水洗，再用3倍量的乙醇洗脱，收集20%洗脱组分，减压回收乙醇，剩余浸膏于真空干燥器中干燥。3.5质量控制赤芍中赤芍总苷质量控制包括性状鉴别（颜色、气味）、薄层鉴别（蓝紫色斑点）、以及对其进行高效液相色谱的含量测定（检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000）以及水分、炽灼残渣，重金属等检测。二、实验目的1.通过赤芍总苷提取纯化工艺与质量控制方案的设计和研究，掌握大孔吸附树脂用于苷类成分纯化的主要影响因素和工艺参数考察的方法，掌握中药五类新药原料的质量控制方法及技术要求。2.通过设计完成中药五类新药赤芍总苷制剂的临床前药学实验研究，掌握中药新药

8、研究程序和中药新药申报资料的技术要求。3.熟悉我国中药新药分类、申报资料要求以及新药审批的基本程序三、实验内容1.赤芍的质量检查1.1性状:本品应呈圆柱形，稍弯。表面棕褐色，粗糙，有纵沟和皱纹，并有须根痕和横长的皮乳样突起，有的外皮易脱落。质硬而脆，易折断，断面粉白色或粉红色，有的有裂隙。气微香，味微苦、酸涩。1.2鉴别:取本品粉末0.5g，加乙醇10ml，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录B）试验，吸取上述两种溶液各4l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲

9、醇-甲酸（40：5：10：0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。1.3含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（40：65）为流动相；检测波长为230nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。供试品溶液的制备取本品粗粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml

10、，称定重量，浸泡4小时，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10l，注入液相色谱仪，测定，即得。本品含芍药苷（C23H28O11）不得少于1.8%。参考文献：2015版中国药典2.赤芍总苷的提取工艺2.1材料与试剂赤芍饮片购自辽宁普兰店，经辽宁省药品检验所王维宁药师鉴定；芍药苷对照品中国药品生物制品检定所；芍药内酯苷对照品自制；D101、AB-8大孔吸附树脂天津南开大学化工厂；HPD-722、HPD-600、DM-130大孔吸附树脂沧州宝恩化工有限公司；乙腈为色谱纯；水为高纯水；其他试剂均为分析纯。2.

11、2仪器与设备FW-100型万能粉碎机天津斯特仪器有限公司；RE52-99旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；KQ-5200DB型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；DK-SZZ型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司；TDL80-2B电动离心机上海安亭科学仪器厂；JA-1003型电子分析天平北京赛多利斯仪器系统有限公司；DZF型真空干燥箱巩义市予华仪器有限责任公司；莱比伦3500G型高效液相色谱仪(配有可变波长紫外检测器和LaballianceEzchromElite色谱工作站)美国SSI公司。2.3方法2.3.1含量测定色谱柱：ThermoC18反相柱(250mm4.6mm，5m)；流动相：乙

12、腈-水(17:83，磷酸调pH3.0)；检测波长230nm；流速1.0mL/min；柱温：25。2.3.2标准曲线的绘制分别精密称取芍药苷、芍药内酯苷对照品8.0、3.2mg置100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。分别精密吸取此对照品溶液3、6、9、12、15L注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积(A)对进样量(g)绘制标准曲线。2.3.3样品溶液的制备称取赤芍粗粉100g，加一定生药量(mL/g)的溶剂提取，过滤，合并提取液，减压真空浓缩成浸膏，60以下蒸成干膏。精密称取干膏0.2g，加甲醇定容至25mL，用HPLC法测定赤芍总苷的含量。2.3.4提取溶剂和方法的选

13、择根据指标成分的理化性质和预实验结果，称取赤芍粗粉100g，分别按照10(mL/g)加入70%乙醇和水提取2次，每次1.5h。2.3.5乙醇提取工艺的优化设计3个试验因素，即A乙醇体积分数、B提取时间、C提取次数。每个因素设3个水平，按L9(34)正交表进行试验。2.3.6乙醇用量的考察精密称取赤芍细粉100g，分别加不同量的70%乙醇，提取3次，每次2h。3.赤芍提取液的纯化工艺的优化3.1树脂上样液的制备取赤芍细粉200g，置2000mL圆底烧瓶内，用1600mL70%乙醇回流提取3次，每次2h，过滤，合并3次提取液，滤液减压真空浓缩至无醇味，约100mL。适量水加热溶解，离心。将离心液转

14、移至1000mL量瓶中，离心加蒸馏水定容至刻度，作为供试液(生药量0.2g/mL)，用HPLC法测定芍药苷和芍药内酯苷的含量。3.2大孔吸附树脂的预处理和型号帅选取AB-8大孔吸附树脂适量，以95%乙醇浸泡24h，除去悬浮物及杂质，湿法装柱，用95%乙醇洗至洗脱液与水(1:5)混合不产生浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味，备用。取已处理好的D101、HPD722、AB-8、DM-130、HPD-6005种型号树脂各10mL置于干净的100mL锥形瓶中，加入100mL供试液，静置24h使之充分吸附(每隔8h超声振动1次)，滤过，用HPLC法测定吸附后的上样溶液中芍药苷和芍药内酯苷的含量，计算5种树脂的静

15、态吸附率。将5种树脂饱和吸附后滤出，精密加入95%乙醇150mL使之解吸，每隔8h超声振动1次，过滤，用HPLC法测定滤液中芍药苷和芍药内酯苷的含量，计算各树脂的静态解吸率。3.3泄漏曲线考察向1根层析柱中加入已经处理好的AB-8型大孔吸附树脂100mL，取400mL供试液上样，流速为1.5BV/h，分段收集泄漏液，每40mL收集1份，测定每个流份的芍药苷和芍药内酯苷的含量，根据每个流份的体积分数绘制泄露曲线。3.4径高比的考察取3种不同粗细的柱子，加入100mL已经处理好的AB-8型大孔吸附树脂使其径高比分别为1:4、1:8、1:12，依次标为1、2、3。以1.5BV/h的流速，上样4.4B

16、V供试液，然后分别用2BV水和5BV95%乙醇洗脱，收集醇洗液，测定芍药苷和芍药内酯苷的含量，计算其解吸率。3.5水洗脱条件的考察取1根层析柱，湿法上柱100mLAB-8型大孔树脂，径高比为1:8。将4.4BV上样液以1.5BV/h的流速通过树脂柱，吸附30min后，以蒸馏水洗脱，分段收集，以苯酚-硫酸法检测洗脱终点，并以TLC检测各流出液中芍药苷和芍药内酯苷是否泄漏。3.6乙醇洗脱体积分数的考察取5根相同型号的层析柱，分别湿法上柱100mLAB-8型大孔树脂，径高比均为1:8。将4.4BV上样液以1.5BV/h的流速分别通过树脂柱，3BV蒸馏水洗脱树脂，再分别用3BV不同体积分数的乙醇洗脱，

17、收集醇洗液，测定芍药苷和芍药内酯苷的含量，计算其解吸率。3.7洗脱流速的考察取3根相同型号的层析柱，分别湿法上柱100mLAB-8型大孔树脂，径高比均为1:8。将4.4BV上样液分别通过树脂柱，用3BV蒸馏水洗树脂，然后用3BV40%乙醇洗脱，3根树脂柱的流速分别为0.9、1.5、2.1BV/h，收集醇洗液，测定芍药苷和芍药内酯苷的含量，计算其解吸率。3.8洗脱曲线的考察湿法上柱100mLAB-8型大孔吸附树脂，径高比为1:8，上样4.4BV上样液以1.5BV/h的流速通过树脂柱，用3BV蒸馏水洗树脂，然后用8BV40%乙醇洗脱，分段收集洗脱液，每份50mL，共收集16份，测定总苷的含量，以总

18、体积分数和份数绘制洗脱曲线。4.赤芍中赤芍苷提取物的质量控制4.1性状：棕褐色粉末，气微香，味微苦、酸涩。4.2鉴别：取本品粉末0.2g，加乙醇10ml，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各4l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：5：10：0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。4.3含量测定：照高效液相色谱法

19、（通则0512）测定。色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（40:65）为流动相；检测波长为230nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。供试品溶液的制备取本品粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，浸泡4小时，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10l，注入液相色谱仪，测定，即得。将提取物中芍

20、药苷含量换算成药材中芍药苷含量，对比药典，检查提取纯化工艺是否合适。2015版中国药典中规定赤芍药材中含芍药苷（C23H28O11）不得少于1.8%。4.4系统适用性试验线性关系考察吸取上述对照品溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml，分别置25ml量瓶内，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10l注入液相色谱仪分析。以进样量（g）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，结果见表12：表12线性关系考察结果芍药苷对照品（ug)峰面积12345精密度试验精密量取已知浓度的芍药苷对照品溶液10l，按液相色谱条件，进样测定6次，结果见表13：表13精密度试验结果

21、峰面积值平均值RSD(%)123456稳定性试验取本品，制备供试品溶液，测定芍药苷于0、2、4、6、8、10小时内峰面积，结果见表14：表14稳定性试验结果时间（小时）峰面积值平均峰面积值RSD(%)0246810重复性试验取本品，一式6份，制备供试品溶液，测定样品中芍药苷含量，结果见表15：表15重复性试验结果样品量（g）芍药苷含量（mg/g）平均含量（mg/g）RSD(%)123456加样回收率试验取已知含量芍药苷的本品6份，每份约10mg，精密称定，分别按样品中芍药苷含量精密加入芍药苷对照品，按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，精密量取续滤液10l，经HPLC分析，测定芍药苷含量，计算回

22、收率，结果见表16：表16加样回收率试验结果取样量（g）样品中芍药苷量（mg）芍药苷对照品加入量（mg）芍药苷测得量（mg）回收率（%）平均回收率RSD(%)4.5水分按中国药典2015年版四部通则0832的第二法项下操作，取本品粉末约1g，平铺于恒重的扁形称量瓶中，厚度5mm，精密称定，打开瓶盖100105，烘5小时，盖好，移至干燥器中冷却30分钟，精密称定，同样温度下在烘1小时移至干燥器中冷却30分钟，精密称定。直至连续两次称定重量之差5mg为止。按减失重量和称样量计算供试样品中水分含量（%）见表17。表17水分含量样品编号水分含量/%平均含量/%1234.6炽灼残渣按中国药典2015年版

23、四部通则0841进行炽灼残渣的检测，取本品粉末约1g，置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓缓织灼至完全炭化，放冷至室温；加硫酸0.5ml使湿润，低温加热至硫酸蒸汽除尽后，在500600炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500600炽灼至恒重。表18炽灼残渣样品编号炽灼残渣/%平均值/%1234.7重金属检查取本品1.0g，按中国药典2015年版四部通则0821重金属检查法二法炽灼破坏，检查3批样品，并同时做空白试验，标准管含Pb10ppm。表19重金属限量样品编号重金属限量123四、实验方案赤芍药材(50g)根据药典方法检查药材质量 70%乙醇加热回流提取， 设计正交试

24、验确定最佳提取工艺参数提取药材，得到提取液 减压浓缩，回收乙醇浓缩液 加水溶解，过滤定容药液 采用单因素试验筛选纯化工艺参数 确定最佳纯化工艺参数最佳工艺醇洗脱液减压浓缩赤芍总苷对赤芍总苷进行质量检查五、实验器材试剂：大孔吸附树脂，色谱纯； 70乙醇，95乙醇，30乙醇，乙腈，冰醋酸，高纯水，分析纯。仪器：高效液相色谱仪，紫外检测器，玻璃柱，旋转蒸发仪，真空干燥器，渗漉桶，电子精密天平，水浴恒温振荡器。六、实验进度及安排日期实验进度安排11月23日药材薄层鉴别：杜敏药材含量测定：冯成瑶提取工艺试验：吴川宜、代敏杰、刘东、谢良、董鑫、周宏灿、周琴11月30日纯化工艺实验：全体成员12月7日赤芍苷

25、薄层鉴别：冯成瑶、吴川宜、代敏杰、刘东赤芍苷含量测定：杜敏、谢良、董鑫、周宏灿、周琴七、人员组成组长：冯成瑶 副组长：杜敏组员：吴川宜、代敏杰、刘东、谢良、董鑫、周宏灿、周琴八、参考文献1周洪伟,许文博,王玉蓉,等.赤芍总苷提取与大孔树脂纯化工艺研究J.中医药学报,2011,39(1),4851.2刘虹,王萌,郝彧,等.大孔树脂纯化赤芍提取物的工艺考察J.天津中医药大学学报,2009,28（3）：142145.3邹忠梅,徐丽珍,杨世林.芍药总苷高效液相色谱指纹图谱研究J.药学学报,2003,38(1):46-49.4周丽.赤芍总苷的提取与分离纯化工艺研究J.食品科技,2008(8):152-1

26、54.5马双成,邓少伟.赤芍总苷的生产工艺条件研究J.中成药,1998,29(10):664-667.6莫晓燕,朴田,赵文娟.赤芍总苷的分离提取和纯化研究J. 食品科学, 2006, 27(2): 152-154.7徐先祥, 周丽, 马燕. 正交实验法优选赤芍提取工艺研究J. 安徽中医学院学报, 2008, 27(5): 41-43.8王文祥,顾明,周巧霞,等.正交实验法优选赤芍总苷提取工艺J.中国野生植物资源,2006,19(3):48-30.9窦志华,罗琳,卢丹.芍药内酯苷、芍药苷双指标考察赤芍总苷大孔树脂纯化工艺J.中药材,2008,40(5):64-66.10白海波,宋子荣,李波.正交

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