杨浦五角场新王牌补习班土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.docx

1、杨浦五角场新王牌补习班土壤中分解尿素的细菌的分离与计数第3课时土壤中分解尿素的细菌的分离与计数目标导读1.了解尿素的作用原理及能被细菌分解的原因。 2.理解并掌握筛选菌落和统计菌落数目的方法及对照实验的设计方法。 3.掌握土壤微生物的取样、稀释、培养和观察。 4.掌握尿素分解菌的鉴定方法。重难点击1.研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。2.能利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数问题。一筛选微生物的研究思路要把某种微生物和其他的微生物分开，就要利用其代谢特点设计合适的培养基。1.筛选菌株(1)实例：DNA多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少量DN

2、A大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温(93 左右)的DNA聚合酶。1966年美国微生物学家布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了水生耐热细菌Taq，从该细菌中分离得到了耐高温的TaqDNA聚合酶。(2)原因：因为热泉温度7080 淘汰了绝大多数微生物，而使耐热的Taq细菌被筛选出来。(3)启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。(4)实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。(5)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培

3、养基。(6)下面是本课题使用的培养基的配方，请分析：KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO47H2O0.2 g葡萄糖10.0 g尿素1.0 g琼脂15.0 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL从物理性质看此培养基属于固体培养基，是由于加入了凝固剂琼脂。从功能上看属于选择培养基，此培养基的氮源只有尿素，能利用尿素的微生物可分泌脲酶，因此能在此培养基上生长，此培养基属于选择培养基。2.统计菌落数目常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。(1)统计菌落数目稀释：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。计数：一般选择菌落数在

4、30300的平板进行计数。统计：通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为使结果接近真实值，可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。(2)活菌数的计算方法：每克样品中的菌株数 (某一稀释度下平板上生长的平均菌落数涂布平板时所用的稀释液的体积)稀释倍数。(3)统计菌落数目：关键是恰当的稀释度。一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。(4)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数来表示。小贴士显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法

5、。1原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个或16个中格，每个中格进一步划分成16个或25个小格，计数室由400个小格组成。2操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数45个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。3计数公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010 000稀释倍数。4缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需

6、要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。3.设置对照 (1)教材中两位同学的统计结果中，第二位同学的结果接近真实值。实验需要改进的操作是第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。(2)设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。设置对照的方法：空白对照：不给对照组任何处理因素；条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素；自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行；相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。(3)教材提供的案例中A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种

7、。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。如何设置对照实验来确定原因？答案方案一：其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照实验的设置是必不可少的。归纳提炼1.选择培养基(1)选择培养基的含义：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离出所需要的微生物。(2)常见的选择培养基加入青霉素可

8、以分离出酵母菌和霉菌。加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。无氮源培养基可以分离固氮微生物。石油是唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。 将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。2.用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项(1)为了保证结果准确，一般设置35个平板，选择菌落数在30300的平板进行计数，并取其平均值。(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。1.在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加

9、入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出()A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌 B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌C.固氮细菌、霉菌、放线菌 D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌问题导析缺乏氮源的培养基，只有固氮菌能够生长；加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌都是细菌，不能生长；培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长，放线菌能够生长。解析固氮细菌可以在无氮培养基上生长；青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，但不会抑制霉菌的生长；加入10%的酚的培养基可以抑制细菌和霉菌的生长，但不会抑制放线菌的生长。2.用稀释涂布平板法来

10、统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是()A.菌落数量最多的平板 B.菌落数量最少的平板C.菌落数量适中的平板 D.取若干个平板菌落数量的平均值问题导析(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。(2)为使结果接近真实值，需取多个平板培养计算出菌落平均数。解析用稀释涂布平板法对样品中活菌数目进行统计，只是一种估测，根据此方法的实验过程可知，在某一稀释度下涂布的平板菌体数具有一定的偶然性，并不是绝对均匀，所以取若干个平板菌落数量的平均值比较接近样品中菌株数的真实值。二实验设计与操作下面是土壤中尿素分解菌的

11、分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析：1.实验设计和操作提示步骤实验操作操作提示土壤取样从酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中取样用的小铁铲和盛土样的信封都要经过灭菌；土壤中的微生物主要分布在距地表38 cm的近中性土壤中，约70%90%为细菌制备培养基分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和尿素为唯一氮源的选择培养基牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用样品的稀释和涂布称取10 g土样加到盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀；吸取上清液1 mL，转移至盛有9 mL的生理盐水的无菌大试管中，按照上图

12、流程进行样品的稀释；按照由107103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管应在火焰旁称取土样；由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围103107倍的稀释液；实验时要对所用的平板、试管作好标记。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等培养将涂布好的培养皿放在3037 温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，才说明选择培养基有选择作用计数当菌落数目稳定时，选

13、取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目如果得到了2个或2个以上菌落数目符合要求的平板，则说明稀释操作比较成功；如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不精确，需要重新实验；在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目2.讨论(1)为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？答案原因：土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的，因此为获得不同类型的微生物就需要按不同的稀释度进行分离。稀释度微生物细菌放线菌

14、真菌稀释度104、105、106103、104、105102、103、104目的：保证获得菌落数在30300的平板进行计数。(2)不同的微生物培养的温度和时间相同吗？答案培养不同微生物往往需要不同培养温度和培养时间。微生物细菌放线菌霉菌培养温度3037 2528 2528 培养天数12 d57 d34 d3.菌落特征：包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。4.菌种的鉴定挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，由于细菌合成的脲酶分解尿素产生了氨，使培养基的碱性增强，pH上升，使指示剂变色，菌落周围变红。归纳提炼分离尿素分解菌操作中的注意事项(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无

15、菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30300个菌落，这个稀释度细菌一般为104、105、106倍液，放线菌一般为103、104、105倍液，真菌一般为102、103、104倍液。(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置空白牛肉膏蛋白胨培养基进行对照。(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板重新制作。1.下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是()A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B.取104、105、106倍的

16、土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上C.将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448小时D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数问题导析(1)设置不同稀释度的土壤稀释液，可以对照说明稀释倍数对细菌计数的影响。(2)对细菌进行计数时，制作的平板大小为每个平板上生长有30300个菌落。解析检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，A项正确；取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于不同的平板上，B项正确；接种后要将培养皿倒置，37 恒温培养2448小时，C项正确；在确定对照组无菌后，应选

17、择菌落数在30300的平板进行计数，D项错误。2.测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释，其原因是()A.细菌个体小，真菌个体大 B.细菌易稀释，真菌不易稀释C.细菌在土壤中数量比真菌多 D.随机的，没有原因问题导析土壤中各类微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离。解析土壤中的微生物大约70%90%是细菌，真菌的数量要比细菌少。样品的稀释度越高，在平板上生长的菌落数目就越少。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30300之间，适于平板计数，

18、所以细菌的稀释倍数要高于真菌的稀释倍数。1.通常用来作为菌种鉴定的重要依据是()A.菌落 B.细菌形态 C.细菌体积 D.细菌结构解析细菌个体非常小，不易直接观察，不同细菌菌落的形态特征不同，而且可以用肉眼观察，因此常作为鉴定菌种的依据。2.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是()A.将土壤用无菌水稀释，制备103106土壤稀释液B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上C.用加入刚果红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌D.从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株解析从土壤中分离以尿素为氮源的细菌时，将土壤用无菌水稀释，制备土壤稀释液；将不同浓度的土壤稀释液涂布于不

19、同平板上；用加入酚红指示剂的鉴别培养基可以鉴别分解尿素的细菌；从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株。3.请选出下列正确的操作步骤()土壤取样称取10 g土壤，取出加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中吸取0.1 mL土壤溶液进行平板涂布依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度A. B. C. D.4.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是()A.筛选出能分解尿素的细菌 B.对分离的菌种作进一步鉴定C.作细菌的营养成分 D.如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素解析筛选出能分解尿素的细菌用选择培养基即可，不需要加指示剂。加入指示剂的培养基，目的

20、是对要分离的菌种作进一步的鉴定。5.尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示，实验步骤如图所示。请分析回答。KH2PO4Na2HPO4MgSO47H2O葡萄糖尿素琼脂1.4 g2.1 g0.2 g10.0 g1.0 g15.0 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。(1)此培养基 (填“能”或“不能”)用于植物组织培养，理由是 。(2)培养基中加入尿素的目的是 ，这种培养基属于 培养基。(

21、3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的 和 ，实验需要振荡培养，原因是 。(4)图中将细菌转到固体培养基上时，可采用 或 在含尿素的培养基上接种，获得单菌落后继续筛选。初步筛选出来的菌种还需要用生化的方法作进一步的鉴定：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若指示剂变成 色，则可准确说明该菌种能够分解尿素。(5)在实验中，下列材料或用具需要灭菌的是 ，需要消毒的是 (填序号)。培养细菌用的培养基与培养皿玻棒、试管、锥形瓶和吸管实验操作者的双手(6)实验结束后，使用过的培养基应该进行 处理后，才能倒掉。解析(1)植物组织培养基中需要含有氮、磷、钾及锌、

22、铜、钼、铁等元素，需要蔗糖为植物细胞提供能量，还需要细胞分裂素和生长素等植物激素。(2)该培养基中尿素是唯一的氮源，只有能利用尿素的微生物才能生长，属于选择培养基。(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的尿素和葡萄糖，分解尿素的微生物是需氧型生物，所以在培养过程中需振荡。(4)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养利用尿素的细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，由此可准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。(5)微生物培养时，一切环境、物质、用具、器材都要消毒或灭菌。(6)为避免实验后培养基中的微生物污染环境，使用过的培养基必须经过灭菌处理后才能丢弃。基础过关知识点一筛选微生物的

23、研究思路1.土壤中分解尿素的微生物所需氮源为()A.硝酸 B.氨 C.尿素 D.蛋白胨解析只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素为氮源，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源使其生长、发育及繁殖受到抑制，所以，能够选择出分解尿素的微生物。2.土壤中的细菌能分解尿素，是因为它们能合成一种()A.尿素酶 B.脲酶 C.蛋白酶 D.肽酶解析能够分解利用尿素的细菌，其细胞内含有脲酶，可以把尿素分解成氨，然后进一步利用。3.产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是()A.一个细菌、液体培养基 B.许多细菌、液体培养基C.一个细菌、固体培养基 D.许多细菌、固体培养基解析在液体培养基中生活的

24、细菌，无论是一个还是许多，肉眼都是看不见的。在固体培养基上的细菌，当数目较少时也是看不见的。当固体培养基上有许多细菌并且集中在较小范围内时，肉眼可见。而菌落是一个细菌或几个细菌的子细胞群体，形成于固体培养基上，有一定的形态结构，所以肉眼可见。同种细菌形成的菌落，形态结构是相同的。如果有许多细菌形成的菌落，就不可能有比较标准的形态，因为这许多细菌第一不可能是同一种细菌，第二不可能在培养基的同一个点上。4.可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是()A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂B.以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入刚果红试剂D.以尿素为唯一氮源的培养

25、基中加入双缩脲试剂解析尿素在尿素分解菌的作用下分解产生氨和CO2，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，酚红指示剂变红。知识点二实验设计与操作5.为了从土壤中分离出尿素分解菌，某同学按照下列配方配制培养基。下列叙述中，错误的是()培养基成分质量KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO47H2O0.2 g葡萄糖10.0 g尿素1.0 g水定容到1 000 mLA.该培养基缺少琼脂 B.该培养基中，尿素是唯一的氮源C.该培养基属于选择培养基 D.需要用刚果红染色法对分离的细菌进行鉴定解析该培养基的目的是分离尿素分解菌，所以应为固体培养基，配方中应该有琼脂成分，A正确；由于该培养基用于分离

26、尿素分解菌，所以尿素应为唯一的氮源，且培养基的种类为选择培养基，B、C正确；刚果红染色法可用于鉴定纤维素分解菌，以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可对分离的细菌进行鉴定，故D错误。6.下列属于菌落特征的是()菌落的形状菌落的大小菌落的多少隆起程度颜色有无荚膜A. B. C. D.解析不同种类的细菌所形成的菌落大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定特征，所以，每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为鉴定的重要依据。单个细菌用肉眼是看不见的，故细菌的个体特征不能作为菌落的特征。7.给无氮培养基接种土壤稀泥浆的方法是()A.打开培养皿盖，取一根接种环沾取少许稀泥浆，轻轻地点接在

27、培养基的表面上B.取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许稀泥浆，略微打开培养皿盖，在培养基的表面轻点C.打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点D.略微打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌，冷却后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点解析接种过程中要防止外来杂菌的入侵，左手将培养皿打开一条缝隙，右手将接种环在火焰上灭菌，冷却后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点，用未冷却的接种环沾取稀泥浆会杀灭菌种。8.若某一稀释度下，平板上生长的平均菌落数为80，涂布平板时所用的稀释液体积为0.1 mL，稀释液的稀释倍数为106，则每克样品中的活菌数约为()

28、A.8108 B.8107 C.8105 D.8106解析每克样品中的活菌数(800.1)106。能力提升9.实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂平板上画3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触)，将平板置于37 条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析，以下叙述不正确的是()A.链霉素能阻止结核杆菌的生长 B.链霉素对结核杆菌比对霍乱菌更有效C.链霉素对结核杆菌比对伤寒菌更有效 D.链霉素可以用于治疗伤寒病人解析从图中可以看出，这是含有链霉素的选择培养基，接种的三种细菌中，霍乱菌和结核杆菌都可以被杀灭，并且链霉素对结核菌杀灭的有效程度大于霍乱菌，而

29、伤寒菌照常生长不受影响，所以选项D错。10.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106倍稀释培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生原因不可能有()A.由于土样不同 B.由于培养基污染C.由于操作失误 D.没有设置对照解析实验结论是否正确与是否设置对照有直接关系，但实验结果与是否设置对照无关。11.下列有关微生物培养的叙述，不正确的是()A.测定土壤样品中的细菌数目，常用稀释涂布平板法进行菌落计数B.在对微生物进行培养前，需要对微生物和培养基进行灭菌C.酵母菌发酵过程产生的酒精，对其他微生物生长有一定的抑制作用D.分离能分解尿素的细菌，要以尿素作

30、为培养基中唯一的氮源解析微生物培养时，为防止杂菌污染需要对培养基进行高压蒸汽灭菌，但是不能对微生物进行灭菌，否则微生物将被杀死。12.用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是()A.涂布了1个平板，统计的菌落数是230B.涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163D.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233解析在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以A、B两项不正确；C项虽涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误。因此，不能简单地用3个平板的计数值求平均值。13.从自然界微生物中筛选某菌种一般步骤是：采集菌样富集培养纯种分离性能测定。(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从合适的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。例如，培养噬盐菌的菌样应