食用菌纤维素酶木聚糖酶漆酶河南地方标准公共服务平台.docx

1、食用菌纤维素酶木聚糖酶漆酶河南地方标准公共服务平台食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程河南省地方标准编制说明一、编制的目的和意义(一)食用菌胞外酶活性检测现状食用菌在生长发育过程向培养基内分泌多种胞外酶，胞外酶是一类在细胞内产生在细胞外发挥作用的酶，这些酶将培养基内的纤维素、半纤维、木质素、蛋白等大分子物质分解成小分子物质供菌丝生长发育，胞外酶活性的大小与食用菌种类、不同的生长发育阶段、培养基的理化性质等因素有关。研究胞外酶活性的，了解不同食用菌胞外酶活性的分泌特点、活性大小和变化趋势，推测不同食用菌在不同生长发育阶段对培养基中木质素等大分子营养物质降解动态，对研究提高栽培技

2、术具有重要意义。目前生产中对可人工栽培和非人工栽培食用菌胞外酶活性的检测均有报道，重点检测纤维酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶、SOD酶等多种酶类。漆酶主要是由真菌分泌的一类胞外多铜氧化酶，真菌漆酶除了具有降解木质素的作用之外，在色素合成、子实体形成、脱毒以及发病机制等方面都扮演了重要的角色。此外，作为一个氧化酶，漆酶也经常被用在农业、工业和药用等领域。测定漆酶酶活方法测定漆酶酶活有三种方法：分光光度计法、微量热法、脉冲激光光声法，测O2 法、高效液相色谱法、极谱法等。分光光度法测定漆酶酶活的基本原理是选定某种漆酶作用的底物, 底物在漆酶催化作用下首先形成底物自由基, 底物自由基浓度与吸光值成正相关

3、, 其在一定的光波波长下存在吸光系数的最大值, 依据吸光值随时间变化的关系计算出酶活。微量热法测定漆酶的活性, 利LKB-2107Batch 型微量热系统, 将其温度调至298K,pH 调至7.4, 此方法漆酶的提取物样品用量较少, 可直接对酶的悬浮液进行测定, 其对反应体系没有任何限制或干扰, 适合研究酶促反应中的酶活。纤维素酶是一类能够水解纤维素的-D-糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称。传统上将其分为3类:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶。纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤

4、维素继续水解成纤维寡糖，-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。木聚糖是木糖残基以木糖苷键连接而构成的，是植物细胞壁中的半纤维素多糖的主要成分，半纤维素降解酶主要指木聚糖酶系。广义的木聚糖酶是能够水解半纤维素的一个复合酶系的总称，主要的酶包括内切木聚糖酶和木糖苷酶。内切木聚糖酶水解木聚糖成木寡糖和木糖残基，而木糖苷酶则对木寡糖的末端

5、进行水解，释放出木糖残基。木聚糖酶能将底物木聚糖降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算待测木聚糖酶的活力。蛋白酶又称蛋白水解酶,其参与了生物体的多种生物过程。它们不仅能催化底物水解,更能调节蛋白质的定位与活性,调节蛋白质与蛋白质的相互作用,参与胞内信号传导以及新的生物活性分子的生成，目前,蛋白酶的活性分析方法可分为均相检测和分离型检测2种。（二）胞外酶活性检测面临的问题漆酶活性的检测方法较多，

6、很多文献报道了至少5种以上不同的测定方法，生产科研中经常采用分光光度法，分光光度法所采用的底物通常为：ABTS、丁香醛连氮、二茂铁等，不论采用哪一种底物，都有自己的不足和局限。以ABTS 为底物测定漆酶酶活是目前国外最为常见的方法之一。它有如下优点： (1) ABTS 易溶于水，在室温下放置6 个月仍较稳定。 (2) 其反应只有一步，即从ABTS 到它的阳离子自由基。ABTS 的阳离子自由基在水溶液中呈浅蓝绿色，且比较稳定，通常在几个小时或几天之内是稳定的。 (3) 在漆酶的作用下，ABTS 有色溶液的摩尔吸光系数较高，说明以其为底物测定的灵敏度较高。 (4) 到目前为止，还未有报道称ABTS

7、 有致癌作用、诱变作用或是强烈的毒性。丁香醛连氮( Syringaladazine)也是漆酶酶活测定较为常见的底物之一。以丁香醛连氮为底物是将其氧化为相应的醌，它的摩尔吸光系数为65 000 L/ (molcm)。其摩尔吸光系数较大，可见用它定性测定漆酶的酶活具有较高的灵敏度。采用McIlvaine 缓冲体系(pH = 5. 0) ，在525 nm 处测定吸光度的增加。 纤维素酶、木聚糖酶活性的检测多数参照文献及饲料行业酶活性检测方法。2005年饲料行业发布了NY/T 912-2004饲料添加剂 纤维素酶活性的测定分光光度法，2009年饲料行业发布了GB/T 2374-2009饲料添加剂木聚糖

8、酶活力的测定分光光度法。食用菌属于真菌，对于不同来源及不同剂型的酶活性的测定需要详细的制定。2012年质检总局发布了GB/T28715-2012饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活性的测定 分光光度法，该方法针对酸性及中性蛋白酶，缺少碱性蛋白酶，同时该方法的原理是利用蛋白酶在一定条件下水解酪蛋白产生有酚基的氨基酸，在碱性条件下与福林试剂生成钼蓝与钨蓝，颜色的深浅与氨基酸含量成正比，在680nm条件吸光度。本标准采用相对于福林法相对简便的方法，其原理为酪蛋白为底物，测定蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质

9、和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，来计算酶的活性。二、任务来源及编制原则和依据食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程由河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所提出申请，河南省质量技术监督局标准院组织专家审核，2017年8月11日文件号：豫质监标发（2017）263号文件，下达立项通知，立项编号：20173210531。本标准针对食用菌胞外纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶四种胞外酶活性的测定原理、定义、所需要的试剂、配制方法、仪器、分析步骤、结果计算等进行进行详

10、细阐述，该方法简便、容易操作，所需大型精密仪器少，较适合科研院所及高校应用。三、编制过程1、成立标准起草小组食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程地方标准获得立项后，负责起草单位河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所，立即协商成立了标准起草小组。召开了第一次会议，确定了起草人员，并协商制定了标准的编写计划，进行了分工。标准起草由河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所负责，查阅文献，补充布置相关试验，收集并整理相关数据。孔维丽负责执笔起草标准的征求意见稿。2、查阅文献与试验2015年至今，标准起草组一直从事平菇、白灵菇、毛木耳等不同种类食用菌胞外酶活性的研究和测定，咨询国内相

11、关行业专家，在总结多年生产实践及试验的基础上，查阅相关标准文献资料等，编写制定食用菌胞外纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程等，整理出了标准编写所需的资料，为起草标准作了文献与科学数据等方面的准备。3、调查生产现状与验证标准起草组成员深入河南省检测检验中心、高校实验室单位和基层研究院所等实地地开展广泛调研，认真听取各方意见和建议，收集相关资料。对标准制定过程存在的问题进行梳理总结，对相关实验进行了必要的检验，获得了真实数据，反馈到相关分析测试中心、实验室等单位，共同讨论、引导各单位在推广应用过程中向标准化、规范化方向发展。4、起草征求意见稿2017年9月中旬，标准编写组对有关文献资

12、料进行了梳理总结，由孔维丽提出了标准编写提纲。同时召开了标准起草小组会议，根据GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写的规定，对编写提纲进行了讨论提出了修改意见。会后由执笔人对标准编写提纲进行了修改，根据编写提纲起草了食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程标准的征求意见稿。10月下旬将征求意见稿发函给河南农业大学申进文、河南农业大学邱立友、河南省科学院生物所贾申茂、河南科技学院王振河共4位专家进行征求意见。11月初下旬共收到4份修改意见，意见返回后，标准起草小组根据征求的意见，经过讨论、再次查阅资料、咨询对标准进行修改和完善，编出了食用菌纤维素酶、木聚糖

13、酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程河南省地方标准征求意见汇总表。根据汇总表的意见对征求意见稿进行了修改，形成了修改稿，上传到网上进行征求意见。四、主要内容的确定（一）标准的编制原则食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程河南地方标准的编制，按照国家有关标准化的法律、法规、标准的规定，主要遵循以下基本原则：1、规范性规范性指起草标准时要遵守与标准制定有关的基础标准及相关法律、法规。本标准的编制严格按照“GB/T1.12009标准化工作导则”第1部分：标准的结构编写。2、适用性本标准的编制根据实际生产需要，结合GBT 23874-2009 饲料添加剂 木聚糖酶活力的测定 NY/T 91

14、2-2004 饲料添加剂 纤维素酶活力的测定、GB/T 28715-2012 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法河南省技术现状、需求、试验条件、从业人员技术水平实际需求等，确定食用菌胞外酶活性检测技术规程参数、方法等，以便于在生产中使用方便，易于推广。漆酶活性的测定是总结文献资料及生产实践得出较为实用、简便、结果稳定的方法。3、统一性统一性是对标准的编写及表达方式的最基本要求。统一性强调的是标准内部的统一。食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程标准编写过程中始终注意前后结构的统一、文体的统一，以及术语的统一。4、协调性统一性强调的是一项标准的内容或一系列标准的内容

15、，协调性是针对标准之间的，他的目的是“为了达到所有标准的整体协调”。因此本标准在编制工艺时所用的术语及定义参照GB/T 12728-2006 食用菌术语，在试剂配制及测定方法上与GBT 23874-2009 饲料添加剂 木聚糖酶活力的测定 、NY/T 912-2004 饲料添加剂 纤维素酶活力的测定、GB/T 28715-2012 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法，相同的部分参照3个标准，详细阐述不同部分及改进的地方。是对上述3个标准的补充和完善。5、完整性完整性是指标准中“范围”一章所规定的界限内标准的内容按照需要力求完整，也就是说完整是有界限的。本标准规定了紫外分光光度法检

16、测食用菌羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶的活力的方法。本标准适用于平菇等食用菌菌丝液体培养、固体栽培过程中羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性的检测。（二）标准编制主要内容确定的依据本标准制定是采用紫外分光光度法检测食用菌菌丝液体培养、固体培养料胞外纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶的活力的方法。结合我省实际栽培技术及发展方向而确定的。其中主要内容确定的依据有以下几个方面：术语和定义、仪器与设备、试剂与溶液的配制、标准曲线的绘制、样品的制备与保存、测定步骤、结果计算等。术语和定义：本文使用的术语符合GB/T 12728-2006 食用菌术语。GBT 23874-2009 饲料添加剂

17、木聚糖酶活力的测定、 NY/T 912-2004 饲料添加剂 纤维素酶活力的测定、GB/T 28715-2012 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法、GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法、GB/T 601-2016 化学试剂 标准滴定溶液的制备、GB/T 9721-2006 化学试剂 分子吸收分光光度法通则里面的术语适用于本标准。本标准规定了四种酶活性的定义。羧甲基纤维素酶活性（CMC酶）：在37 ，pH值为5.5，每分钟从浓度为0.8%的羧甲基纤维素钠溶液中降解1 mmol还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位（U）。木聚糖酶活性：在37 ，pH值为5.5，每分钟从浓度

18、5mg/mL的木聚糖溶液中降解1mol还原糖所需要的酶量为1个酶活单位（U）。蛋白酶活性：在40，相应pH值（中性蛋白酶pH值=7.5，酸性蛋白酶pH值=3，碱性蛋白酶pH值=13）1 min水解酪素产生1g酪氨酸所需要的酶量为1个酶活性单位（U）。漆酶活性：漆酶分解2,2- 联氮- 双-3- 乙基苯并噻唑- 6- 磺酸（ABTS），产物为ABTS自由基，(在室温（2530 ），pH值为5（0.08 mol/L醋酸钠缓冲液）条件下，以每秒钟氧化1 mmol的 0.5 mmol/L ABTS所需的酶量定义为1个酶活力单位（U）。仪器和设备：本标准规定了分析所需要的基本仪器设备。紫外可见分光光度计

19、（Blue star A），符合GB/T 9721-2006 化学试剂 分子吸收分光光度法通则(紫外和可见光部分)对仪器的要求和测定方法、pH计(上海佑科E-201-9 型)、电子天平：精确至0.0001g、数显恒温水浴锅、磁力搅拌器（加热功能）、低温高速离心机（SIGMA）。试剂与溶液：标准详细列举了所需要试剂及配置方法。与GBT 23874-2009 饲料添加剂、木聚糖酶活力的测定 、NY/T 912-2004 饲料添加剂 纤维素酶活力的测定、GB/T 28715-2012 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法相同的试剂参照三个标准所规定方法。绘制标准曲线：纤维素酶、木聚糖酶参

20、照NY/T 912-2004 饲料添加剂 纤维素酶活力的测定、GBT 23874-2009 饲料添加剂、木聚糖酶活力的测定方法，本标准规定了漆酶、蛋白酶活性标准曲线的绘制方法。待测酶液的制备：食用菌胞外酶活性的测定包括两种，一种为固体培养条件下菌丝体胞外酶，一种为液体培养条件下菌丝体胞外酶活性，液体培养液采用 2层纱布过滤取上清液，12000 r/min，离心20 min，得到待测酶液。固体原料碾碎，称量50g，重复3份，加5倍去离子水三角瓶内，25浸提3 h，2层纱布过滤取上清液12000 r/min，离心20 min，得到待测酶液。酶活性的测定：包括酶液的稀释与测定。纤维素酶、木聚糖酶待测

21、固体酶液用缓冲液稀释1020倍，液体酶液用缓冲液稀释2025倍，测定的OD值最大值在0.50.6之间为宜。羧甲基纤维素酶参照NY/T 912-2004 饲料添加剂 纤维素酶活力的测定方法。木聚糖酶活性的测定参照GB/T 23874-2009 饲料添加剂 木聚糖酶活力的测定蛋白酶活性测定本标准与GB/T 28715-2012 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定方法不同，减少了福林试剂的配制与使用，待测固体酶液用缓冲液稀释1025倍，液体酶液用缓冲液稀释50倍，测定的OD值最大值在0.50.6之间为宜。漆酶：采用ABTS法。计算：纤维素酶、木聚糖酶参照NY/T 912-2004 饲料添加剂 纤维

22、素酶活力的计算方法、GBT 23874-2009 饲料添加剂、木聚糖酶活力的计算方法。本标准规定了漆酶、蛋白酶活性的计算公式。五、与国家法律法规和强制性标准的关系食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程标准制定的方法，所使用的试剂、配制方法，原料的处理及保存均=符合GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法、GB/T 601-2016 化学试剂 标准滴定溶液的制备、GB/T 9721-2006 化学试剂 分子吸收分光光度法通则所引用的有关标准均为最新现行标准，与现行法律、法规和强制性国家标准相符。六、标准实施的建议结合本省实际，贯彻落实食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶

23、活性检测技术规程河南省地方标准建议采取以下措施：（一）采取多种形式，加大宣传力度，借助河南省食用菌协会、河南省食用菌产业技术体系、国家食用菌产业技术体系、高校、科研单位、龙头企业等开展育种等相关研究研究，培训、介绍该标准操作技术规程，了解标准内容和有关法规政策，提高对标准的认识，规范操作流程，提高育种效率，提高新品种质量。（二）河南省质监局网站及时发布通过审定的标准，使用者通过各种形式登录查询、检索该标准内容，通过后台监督，进行标准实施情况的监督检查，发现问题及时进行指导，使标准落到实处。（三）建立健全地方标准的管理制度，经常听取标准使用者的意见，按时对标准进行修订，以适应生产和技术发展的需要。食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程河南省地方标准起草组2017年11月1日