噬菌体随机肽库 中文说明书 phage display.docx

1、噬菌体随机肽库 中文说明书 phage display简介 2 培养基和溶液 5 常规M13方法 .6 淘选程序（固定靶分子）.8 结合克隆的特征.12 其他淘选方法（液相结合法）.15 其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法）.16 附录：优化肽结合相互作用.19 文库的氨基酸分布.21 试剂盒组成： （如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20保存）： 随机十二肽噬菌体展示文库 100 l, 1.51013 pfu/ml。贮存于含50%甘油的TBS溶液中。复杂度 2.7109个转化子。 -28 gIII测序引物 5-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-

2、3, 100 pmol, 1 pmol/l -96 gIII测序引物 5-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3, 100 pmol/l, 1 pmol/l E.coli ER2738宿主菌 F lacIq (lacZ)M15 proA+B+ zzf:Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi (lac-proAB) (hsdMS-mcrB)5 (rk m k McrBC)。该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。贮存于-70。 链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉 1.5 mg 生物素，10 mM 100 l Ph.D.TM是New

3、England Biolabs, Inc. 的注册商标。 概述噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列

4、。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。 展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋白质-蛋白质相互作用（7）和鉴定非肽配体的肽模拟型（8-11。）生物活性肽分子的鉴定可以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选（12）也可以在完整细胞上进行淘选（13-15）。蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和tag，然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体（16）。另外，大的蛋白质分子如：抗体（17）、激素（18）、蛋白酶抑制剂（19）、酶（20）和结合蛋白（21）也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的筛选，分离出各种具有

5、亲和力或特异性改变的变异株。 Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，因而是一个组合文库。所展示的十二肽表达在pIII的N末端，即：成熟蛋白的第一个氨基酸就是随机十二肽的第一个氨基酸, 十二肽后面是一段短小的间隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser组成，然后是野生型pIII蛋白。该文库含有2.7109个电转化序列，用10 l本品提供的噬菌体进行扩增，每个序列一次可产生55个拷贝，对原始文库进行大量测序（见附录）表明该文库序列具有广泛的多样性，无明显的残基位置偏嗜。建议不要扩增原始文库来进行另外的淘选试验，因为一旦再扩增便会出现序列偏嗜现象

6、。 NEB应用本品分别鉴定出了与链霉亲和素和单克隆抗体相结合的共有结合肽序列（见图2）。大量实验证明，任何情况下该文库的复杂度都足以产生多个可编码相同肽基序的DNA序列。图2用Ph.D.-12肽库测定抗原决定簇。用抗?-内啡肽单克隆抗体对Ph.D.-12展示肽文库进行液相淘选，然后用ProteinA-琼脂糖（第1和第3轮淘选）或Protein G-琼脂糖(第2轮淘选)亲和捕获抗体-噬菌体复合物。每轮淘选所选到的结合序列与R-内啡肽的前12个氨基酸残基序列比较列于上图内，共有序列元件用方框示出。结果清楚地显示该抗体的抗原决定簇序列落在R-内啡肽的前四个氨基酸残基（YGGF）处，在第三位有一定的可

7、变性。第三轮筛有一个筛选到的克隆无插入子。培养基和溶液LB培养基：每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl。高压灭菌，室温贮存。 LB/IPTG/Xgal平板： LB培养基 + 15 g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70时，加入1 ml IPTG/Xgal*，混匀倒平板。平板4避光贮存。 顶层琼脂：每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl, 1 g MgCl26H2O, 7 g琼脂粉。高压灭菌，分成50 ml等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。 四环素贮液：以20

8、 mg/ml的浓度溶于乙醇中。-20避光贮存。用前摇匀。 LB-Tet平板：LB培养基 + 15 g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70时，加入1 ml四环素贮液，混匀倒平板。平板4避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。 封阻缓冲液：0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3。过滤除菌，4贮存。 TBS: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl。高压灭菌，室温贮存。 PEG/NaCl: 20% (w/v) PEG-8000, 2.5 M NaCl。高压灭菌，室温贮存。 碘化物缓冲液：10 mM Tris-HCl

9、 (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaCl。室温避光贮存。 链霉亲和素贮液：将1.5 mg链霉亲和素冻干粉（本试剂盒提供）溶于1 ml 10 mM磷酸钠(pH7.2)、100 mM NaCl、0.02% NaN3溶液中。4或-20贮存，避免反复冻融。 *IPTG/Xgal配方：将1.25 g IPTG (isopropyl D-thiogalactoside)和1 g Xgal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside)溶于25 ml二甲基甲酰胺中。溶液-20避光贮存 常规M13方法M13不是一个裂解性噬菌体，噬菌斑的形成不是由于菌体裂

10、解而是由于细胞生长力减弱所致，因此其噬菌斑是浑浊的而不是清亮的。 菌株保存1. 本试剂盒提供的宿主菌是一个强F+菌株，生长迅速，特别适合于M13噬菌体的增殖。尽管ER2738是一个recA+菌株，但我们在使用M13或噬菌粒载体的过程中从未发现有体内重组现象发生。其他F+的商品菌株如：DH5F和XL1-Blue或许可以代替ER2738应用,但未曾用本系统检验过。 2. 由于M13是一个雄性特异性大肠杆菌噬菌体，建议用于M13增殖的所有菌液都是从F因子正向选择培养基上挑菌接种的，而不是直接从本试剂盒提供的甘油菌接种培养的。ER2738的F因子上含有一个小转座子，赋予该细胞四环素抗性，因此可以在含四

11、环素的平板上铺板筛选含F因子的细胞。 3. 从随产品提供的ER2738甘油菌划线接种LB-Tet平板，倒置平板37培养过夜。用封口膜封闭平板后4避光保存，最长可达一个月。 4. 用于感染噬菌体的ER2738菌液既可以在LB也可以在LB-Tet培养基中生长。只要不对培养物进行连续稀释，在非选择性培养基中F因子的丢失并不严重。 避免噬菌体污染M13噬菌体的衣壳蛋白pIII通过与受体菌的F性纤毛相结合而介导感染。与野生型噬菌体相比，外源蛋白或多肽融合在pIII蛋白的N端展示明显降低了文库噬菌体的感染力。因此，当有任何野生型噬菌体污染时，每轮淘选试验之间的扩增步骤会强烈倾向于扩增野生型噬菌体，如果同时

12、没有一个强有力的体外噬菌体结合选择程序来避免，即使痕量水平的污染也会在三轮淘选后使淘选出的噬菌体多数为野生型。 1. 在本手册所述的所有步骤中均使用带滤芯吸头，可以使污染外界环境中噬菌体的可能性大大降低。 2. 由于文库噬菌体源于常规克隆载体M13mp19，其含有lacZ基因，当铺在含IPTG和Xgal的平板上时，噬菌斑将呈蓝色。而外界污染的丝状噬菌体在同样的平板上将呈白色噬菌斑，同时这些噬菌斑还会比文库噬菌体的噬菌斑更大更模糊。因此所有的滴度检测步骤，建议一定要在LB/IPTG/Xgal培养基上铺板，如果有白色噬菌斑，则只挑取蓝色噬菌斑进行测序。 测定噬菌体滴度只有当噬菌体的感染复度MOI

13、(multiplicity of infection)值远低于1时（即细胞过量时），噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。正因如此，建议检测噬菌体贮液的滴度时，在感染前进行稀释，而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。 1. 接种ER2738单菌落于5-10 ml LB培养基中，摇床培养至对数中期（OD600 0.5）。 2. 细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3 ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45备用。 3. 37预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。 4. 在LB中准备10倍系

14、列稀释的噬菌体。 建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。 5. 当菌体培养物达对数中期，分成200 l等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。 6. 每管加入10 l不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5 min。 7. 将感染细胞加入45预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。 8. 待平板冷却5 min后，倒置于37培养过夜。 9. 检查平板，计数有102个噬菌斑的平板上的斑数。然

15、后用此数目乘以稀释因子即得到每10 l噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。 淘选程序最简单直接的淘选方法有：直接将靶分子包被于塑材表面（通过非特异的疏水作用或静电相互作用），洗去过量的未吸附分子，然后将噬菌体库覆盖在已包被的靶分子的表面。根据靶分子的不同，直接包被法偶尔会导致配体结合位点难以进入，这或许是由于分子的立体封阻或许是由于靶分子表面的部分变性而引起。在这些情况下，可先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于链霉亲和素包被的表面（见15页）或其他亲和介质上（见16页）。由于直接包被法相对简单，建议先按以下步骤试用此方法。如果没有淘选到明显的共有结合序列，再进行上述液相结合试验中的一种。 第一天 根据需同时在其上进行文库淘选的靶分子的数量和种类不同，淘选试验