平面色谱法山西医科大学.docx

1、平面色谱法山西医科大学第十九章 平面色谱法 平面色谱法（plane chromatography）是组分在以平面为载体的固定相和流动相之间吸附或分配平衡而进行的一种色谱方法。该法具有操作简单，不需要昂贵的仪器设备，分析速度快，结果直观，并有较高的分离能力。平面色谱法主要包括薄层色谱法（thin layer chromatography；TLC）和纸色谱法（paper chromatograph）。纸色谱法出现于20世纪的40年代，主要用于微量分析，特别在生化和医药分析中的应用十分广泛。但色谱纸的机械强度较差，传质阻力大，使该法的应用和推广受到了限制。20世纪60年代，薄层色谱法的发展和普及，使

2、得纸色谱法的应用逐渐减少。20世纪80年代出现了仪器化薄层色谱法（instrumental thin layer chromatography），薄层色谱的每一步骤均由仪器来代替以往的手工操作，再配以薄层扫描仪，这样就使在较长时期内被认为只能用来定性和半定量的薄层色谱法定量结果的重现性和准确度大大提高，成为一种有价值的分离分析方法。第一节 平面色谱法的分类和原理一、 平面色谱法的分类平面色谱法按操作方式可分为：1薄层色谱法 薄层色谱法是把固定相均匀地涂布在玻璃板、塑料板或铝箔上形成厚薄均匀的薄层，在此薄层上进行混合组分分离的色谱法。按照薄层色谱法的分离机制不同，薄层色谱法又可分为吸附薄层色谱法

3、、分配薄层色谱法和分子排阻薄层色谱法。2纸色谱法 纸色谱法的固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为与水互不相溶的有机溶剂，根据被分离混合组分在水和有机溶剂中的溶解能力不同，在色谱纸上产生差速迁移而得到分离的方法。纸色谱分离原理属于分配色谱的范畴。3薄层电泳法 薄层电泳法是带电荷的被分离物质（蛋白质、核苷酸、多肽、糖类等）在纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等惰性支持体上，以不同速度向其电荷相反的电极方向泳动，产生差速迁移而得到分离的方法。薄层电泳法属于平面色谱范围，但由于电泳与色谱的驱动力、仪器设备及测定对象与薄层色谱法及纸色谱法有较大差别，故本章不予介绍。二、 平面色谱法参数平面色

4、谱与柱色谱的基本原理相同，但操作方法不同，故各种参数也不完全相同。以下主要介绍平面色谱法的定性参数、相平衡参数、面效参数和分离参数。（一）定性参数薄层色谱的定性参数是色谱过程热力学特性参数，包括比移值与相对比移值。1比移值（retardation factor；Rf） 比移值是在一定条件下，溶质移动距离与流动相移动距离之比。是平面色谱法中用来表征平面色谱图上斑点位置的基本参数，也是平面色谱法用于定性的基本参数。 （19-1） 式中L为原点（origin）至斑点中心的距离，L0为原点至溶剂前沿（solvent front）的距离（见图19-1）。当Rf =0时，组分不随流动相展开，停留在原点，表

5、示组分在固定相上完全保留；当Rf =1时，组分随流动相展开至溶剂前沿，表示组分在固定相上完全不保留。所以Rf值在01之间。在实际工作中，Rf值适宜范围是0.20.8，最佳范围是0.30.5。图19-1 平面色谱示意图由于Rf受被分离组分的结构和性质，固定相和流动相的种类和性质，展开室内的饱和度、温度等多因素的影响。在不同实验室或不同实验者间进行同一化合物Rf值的比较是很困难的。2相对比移值（relative retardation factor；Rr） 相对比移值是在一定条件下，被测组分的比移值与参考物质比移值之比。 （19-2）式中Rf (i)和Rf (s)分别为组分i和参考物质s在相同条件

6、下的比移值。L(i)和L(s) 分别为组分i和参考物质s在平面色谱上的移动距离。相对比移值在一定程度上消除了测定中的系统误差，因此与比移值相比具有较高的重现性和可比性。测定Rr时，可以选择纯物质加到试样中作为参考物质，也可以是试样中的某一已知组分。Rr可以大于1，也可以小于1。Rr与被测组分、参考物质、色谱条件等因素有关。（二）相平衡参数1分配系数（distribution coefficient；K）和保留因子（retention factor；k） 平面色谱法中的相平衡参数也可用分配系数和保留因子来描述（见第十六章 色谱法概论）。2K、k与Rf值之间的关系 设R为单位时间内一个分子在流动相

7、中出现的几率（即在流动相中停留的时间分数），若R=1/3，则表示这个分子有1/3的时间在流动相中，2/3的时间在固定相中。对于具有统计意义的大量待测组分分子而言，则表示1/3的分子在流动相中， 2/3的分子在固定相中。组分在固定相与流动相中的量可分别用csVs和cmVm表示，cs为组分在固定相中的浓度，cm为组分在流动相中的浓度，Vs为色谱平面中固定相所占的体积，Vm为平面中流动相所占的体积。因此， 整理上式，得 R也可表示组分分子在平面上移动的速度，若R=1/3，则表示组分分子的速度(u)为流动相分子速度(u0)的1/3(u/u0)，即该组分分子移行的距离是溶剂前沿移行距离的1/3。由此可得

8、，在平面色谱中，组分分子与流动相分子的移行时间是相同的（定时展开），所以，即 （19-3） 或 （19-4） （19-5） 由（19-5）可知：（1）由于组分不同，热力学常数K值不同，在平面色谱上的Rf不同，所以平面色谱可以把不同的组分分离出不同的斑点。（2）当K（k）100时，0，此时L=0，表示组分停留在原点，完全被固定相所保留。因此平面色谱一般要求：0.01K100。（3）由（19-5）得 （19-6）由上式可知，只要测出某组分在液-液分配薄层色谱体系的，并已知流动相和固定相体积比Vm/Vs，即可测出该体系的分配系数K。（三）面效参数1理论塔板数（number of theoretica

9、l plate；n） 理论塔板数是反映组分在固定相和流动相中动力学特性的色谱参数，是色谱分离效能的重要指标。以下式表示： （19-7）式中L为原点到斑点中心的距离，W为组分斑点的宽度，因此在斑点移动距离相等的情况下，斑点越集中，W越小，n越大，说明面效越高。在平面色谱法中的理论塔板数主要取决于平面色谱系统的物理特性，如固定相的粒度、均匀度、活度、色谱纸的厚薄及其均匀度，展开剂的流速及展开方式等。2塔板高度（height of theoretical plate；H） 塔板高度是由理论塔板数及原点到展开剂前沿的距离(L0)算出的单位理论塔板的长度。即： （19-8）由此可见，H与n成反比，n值越

10、大，H值越小，面效就越高。（四）分离参数1分离度（resolution；R） 分离度是两相邻斑点中心距离与两斑点平均宽度的比值，是平面色谱法的重要分离参数。即： （19-9）式中L2、L1分别为原点至两斑点中心的距离，d为两斑点中心间的距离，W1、W2为两斑点的宽度；在薄层扫描图上，d为两色谱峰顶间距离，W1、W2分别为两色谱峰宽（见图19-2）。在平面色谱法中，R1较适宜。 图19-2 平面色谱分离度示意图2分离数（separation number；SN） 分离数是在相邻两斑点分离度为1.177时，在Rf=0和Rf=1两组分斑点之间所能容纳的色谱斑点数。即： （19-10）式中(W1/2)

11、0和(W1/2)1分别为由薄层扫描所得的Rf=0和Rf=1的组分的半峰宽。实际上，(W1/2)0和(W1/2)1均不能直接由薄层扫描图上测得。而是通过测量其他组分的Rf值和半峰宽，二者在一定点样量范围内成直线关系，由回归方程外推求得(W1/2)0和(W1/2)1。分离数也是平面色谱法的重要分离参数和面效的评价参数。在一定分离度下，分离数SN越大，平面的容量越大。一般薄层板的SN在10左右，高效薄层板可达20。第二节 薄层色谱法薄层色谱法是平面色谱法中应用最广泛的方法之一。将细粉状的吸附剂或载体（固定相）涂布于玻璃板、塑料板或铝箔上，成一均匀薄层并进行活化，将试样与对照品溶液点在同一薄板的一端（

12、原点），在密闭的容器中用适当的溶剂（流动相或展开剂）展开，显色后样品斑点与对照品斑点进行比较，用于定性鉴别和含量测定。铺好薄层的板，称为薄板或薄层板（thin layer plate）。薄层色谱法具有以下特点：分离能力强，斑点集中。灵敏度高，几微克，甚至几十纳克的物质也能检出。展开时间短，一般只需十至几十分钟。一次可以同时展开多个试样。试样预处理简单，对被分离组分性质没有限制。上样量较大。所用仪器简单，操作方便。因此在实际工作中特别是基层实验室薄层色谱法是一种被广泛应用的分离分析技术。一、 薄层色谱法的主要类型根据薄层色谱法的分离机制，可分为吸附薄层色谱法、分配薄层色谱法和分子排阻薄层色谱法，

13、此外，还有胶束薄层色谱法等。根据分离效能，薄层色谱法又可分为经典薄层色谱法和高效薄层色谱法。本节主要讨论吸附薄层色谱法。（一）吸附薄层色谱法吸附薄层色谱法是以吸附剂为固定相的薄层色谱法。在吸附薄层色谱中，将含有A、B两组分的混合溶液点在薄层板的一端，在密闭的容器中，用适当的溶剂展开。在展开过程中A、B两组分首先被吸附剂吸附，然后被展开剂溶解而解吸附，并随展开剂向前移动，遇到新的吸附剂A、B两组分又被吸附、随后又被展开剂解吸附。由于A、B两组分在吸附剂和展开剂中的吸附系数不同，在薄层板上进行无数次的吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，吸附系数大的在板上移动速度慢，Rf值小；吸附系数小的在板上的移动速

14、度快，Rf值大，在薄层板上产生差速迁移而得到分离。在吸附色谱中，一般极性大的组分Rf值小，极性小的组分Rf值大。（二）分配薄层色谱法分配薄层色谱法是以液体为固定相的薄层色谱法。利用试样中各组分在固定相与流动相之间的分配系数不同，在薄层板上进行无数次的分配，分配系数大的组分在板上移动速度慢，Rf值小；分配系数小的组分在板上的移动速度快，Rf值大，在薄层板上产生差速迁移而得到分离。根据固定相和流动相极性的相对强弱，分配薄层色谱法可分为正相薄层色谱法和反相薄层色谱法。1. 正相薄层色谱法 正相薄层色谱法是流动相的极性小于固定相极性的薄层色谱法。正相薄层色谱中组分极性越大，分配系数越大，随展开剂移动的

15、速度越慢，Rf值越小。正相薄层色谱法常用的固定相是含水硅胶，展开剂是极性较弱的有机溶剂。2. 反相薄层色谱法 反相薄层色谱法是流动相的极性大于固定相极性的薄层色谱法。反相色谱中组分极性越小，分配系数越大，随流动相移动的速度越慢，Rf值越小。反相薄层色谱法常用的固定相是烷基化学键合相，展开剂是水或水-有机溶剂的混合溶剂。二、 吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂(一)吸附剂吸附薄层色谱法的固定相为吸附剂（absorbent），常用吸附剂有硅胶、氧化铝和聚酰胺等。1硅胶 硅胶是吸附薄层色谱中最常用的固定相。硅胶是多孔性无定形粉末，其表面带有硅醇基（silanol）呈弱酸性，通过硅醇基吸附中心与极性基团形成氢键而表现其吸附性能，由于不同组分的极性基团与硅醇基形成氢键的能力不同，在硅胶作为吸附剂的薄板上被分离。硅胶吸附水分形成水合硅醇基而失去吸附能力，但将硅胶在105110左右加热时，可失去水而提高活度，增加吸附能力，这一过程称为“活化”（activation）。硅胶的活度与含水量的关系见表19-1。含水量越多，级数越高，吸附能力越弱，同一组分在此硅胶上的Rf值越大；含水量越少，级数越低，吸附能力越强，同一组分在此硅胶上的Rf值越小。硅胶的分离效率的高低与其粒度、孔径及表面积等几