马铃薯快速繁殖实验结果.docx

1、马铃薯快速繁殖实验结果一实验设计方案实验序号实验名称实验时间实验室（一）实验目的1、通过本次实验，进一步熟悉无菌操作技术；2、熟悉马铃薯快繁培养基及试管薯诱导培养基的配置方法；3、掌握配制培养基的步骤，能熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方；4、了解马铃薯脱毒种薯生产的过程，为马铃薯脱毒种薯的生产提供必要的基础苗。 5、通过本次实验，使学生能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂，巩固相关理论基础知识。（二） 实验原理、实验流程或装置示意图 1、实验原理 马铃薯是高度杂合的，因此它们的种子后代不可能与原种完全相同。只有由无性繁殖产生的植株，在遗传上才能与其亲本植物

2、完全相同，从而可使品种的特性代代相传；短枝发生型是指外植体携带的带叶茎段，在适宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成带叶茎段，继代再成苗的繁殖方法。该方法与田间枝条的扦插繁殖方法类似，故又称为微型扦插。能一次成苗，遗传性状稳定，培养过程简单，移栽成活率高。许多花卉、葡萄、马铃薯等试管苗的繁殖常用此方法。利用植物组织培养技术，在无菌条件下对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法称为植物离体无性繁殖。在黑暗环境的诱导下，马铃薯试管苗可以在试管薯诱导培养基中结出种薯，且悬于茎秆上。马铃薯试管薯是利用茎尖分生组织脱毒技术，在组织培养条件下高倍扩繁脱毒试苗，进而诱导试管苗

3、所形成的块茎。试管薯具有无病原、体积小、贮藏运输方便、能工厂化周年生产。微型薯是指通过组织培养方法，在试管中生产的马铃薯块茎他的体积小、重量轻，一般只有1-5克，从而为马铃薯优良种质的保全提供了一条理想的途径。 马铃薯试管苗在光照条件下进行自养的程度大于异养。相反，在高浓度的糖类存在的情况下，以及在无光照的限制条件下，马铃薯向着诱导生成试管薯的过程。这样生长出来的试管薯称之为原原种种薯。培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质。配制培养基时，为了减少试剂称取时的工作量和少量称取时出现的误差，以及避免多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，预先要将各种营养成分配制为一定倍数

4、的培养基母液，待使用时稀释到要求的浓度。母液的浓度为培养基浓度的10倍、100倍或更高。 不论液体培养还是固体培养，大多数植物组织培养中所用的培养基都是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉溶解在蒸馏水里，加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，再加入蒸馏水使之达到最终的容积。最后调节pH值，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。 如果没有培养基干粉，则可采用以下两种方法来配制：一个是按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们混合在一起。另一个是先配制一系列的浓缩贮备液（母液），贮存在24冰箱内，待配培

5、养基时取出，按比例稀释配用。此法较为常用。母液的配制有两种方法：、配制成单一化合物母液。此法适合配制多种培养基都需要的同一种母液。、配成几种不同化合物的混合母液。此法在大量配制同种培养基时省时省力。由于MS 培养基较为常用，故配制MS 培养基母液。配好的母液应放在试剂瓶中贮存。本实验采用后者配制母液。 将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。培养基配方设计：（1）根据培养的目的选择一种培养基为基本培养基。（2）确定培养基中各种激素的浓度及相对比例。本实验中马铃薯试管苗快速繁殖培养基为MS培养基。诱导培养基的

6、配方如下： MS培养基+5mg/L 6-BA+8%蔗糖。2、实验流程（1）实验总体流程（2）母液配制流程（3）马铃薯试管苗快速繁殖培养基的配制流程（三）实验设备及材料1、实验设备果酱瓶、500mL搪瓷杯、三角瓶、烧杯、容量瓶、玻璃棒、25mL量筒、1mL和5mL移液管、洗耳球、PH试纸、封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、普通电子天平、酒精棉球、小块纱布、灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、超净工作台、冰箱、高压蒸汽灭菌锅、电磁炉、记号笔。2、药品和试剂（1）母液配制：硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二

7、钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA（-萘乙酸）、 6-BA （ 6-苄基腺嘌呤）、浓盐酸、氢氧化钠、95%酒精、蒸馏水等。（2）马铃薯快速繁殖培养基及诱导培养基的配制：事先配好的MS基本培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1molL-1HCl、1molL-1NaOH等。（3）其他：75% 酒精等。3、实验材料马铃薯脱毒苗 （四）实验方法步骤1、MS培养基母液和常用试剂的配制（1）大量元素母液的配制MS培养基中的9种大量元素除C、H、O外，剩下的六种可由KNO3、NH4NO3、CaCl2 2H20、MgSO4 7H2O、

8、KH2PO4几种无机盐来供应，它们可配在同一母液中（具体配制见下表）。配制的步骤为：确定母液的浓度和体积计算各种化合物用量称量分别溶解混合定容装瓶贴标签放入冰箱保存。注意： CaCl2 2H20最后加入母液种类 成 分 规定用量/mg L-1 扩大倍数 称取量/mg 母液定容体积/ml 配1L MS培养基吸取取量/ml 大量元素 KNO3190020 380001000 50 NH4NO3165033000CaCl2 2H204408800MgSO4 7H2O3707400KH2PO4 170 3400 （2）微量元素母液的配制MS培养基中的微量元素可由MnSO4 4H2O、ZnSO4 7H2

9、O、H3BO3、KI、Na2MoO4 2H2O、CuSO4 5H2O、CoCl2 6H2O几种无机盐来供应，它们也可配在同一母液中（具体配制见下表）。配制步骤同大量元素（混合时不要求先后顺序）。母液种类 成 分 规定用量/mg L-1 扩大倍数 称取量/mg 母液定容体积/ml 配1L 培养基吸取量/ml 微量元素 MnSO4 H2O16.9200338010005ZnSO4 7H2O8.61720H3BO36.21240KI0.83166Na2MoO4 2H2O0.2550CuSO4 5H2O0.0255CoCl2 6H2O 0.0255 （3）有机成分母液的配制MS培养基中所需的维生素和氨

10、基酸等有机成分母液应分别单独配制（具体配制见下表）。配制的步骤为：确定母液的浓度和体积计算各种化合物用量称量溶解定容装瓶贴标签放入冰箱保存。亦可配制成混合母液（不主张采用）。母液种类 成 分 规定用量/mg L-1 扩大倍数 称取量/mg 母液定容体积/ml 配1L MS培养基吸取量/ml 有机成分 甘氨酸2.02001002505盐酸硫胺素0.15盐酸吡哆素0.525烟酸0.525肌醇1005000（4）铁盐母液的配制铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为：确定母液的浓度和体积计算各种化合物用量称量分别溶解混合煮沸数分钟调节pH值至5.8 定容装瓶（棕色）贴标签放入冰箱保存。用时每配l L培养基取

11、该溶液5ml。母液种类 成 分 规定用量/mg L-1 扩大倍数 称取量/mg 母液定容体积/ml 配1L MS培养基吸取量/ml 铁盐 Na2EDTA 2H2O37.320018652505FeSO4 7H2O27.81390（5）植物生长调节物质母液的配制对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mgml-1或 ppm 较为方便，一般配制成0.1-1mgml-1的母液，这样的浓度便于计算也可避免冷藏时形成结晶。2,4-D/NAA用少量95酒精溶解，再加水定容；6-BA应先溶于少量1 molL-1的HCl中，再加水定容。 具体配制见下表：母液种类 成 分 称取量(mg )母液定容体积(ml)

12、 母液浓度(mg/ml)生长调节物质2,4-D/NAA501000.56-苄氨基嘌呤100.1（6）其它常用试剂的配制盐酸（lmolL-1 ）：用浓度36.5%、密度1.19g/cm3的浓盐酸配制。本次试验用8.4ml配制。氢氧化钠（lmolL-1 ）：用固体氢氧化钠配制。本次试验用4g配制。75%酒精(v/v) ：用95%的酒精来配制（7）配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、配制者、配制日期。（8）母液最好在24的冰箱中保存。尤其对生长调节物质与有机类物质要求较严。贮存时间不宜过长，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用。2、马铃薯试管苗快速繁殖培养基的配制基本配方：M

13、S基本培养基0.7琼脂3蔗糖每小组配制0.5L（1）药品及用具的准备配制培养基时先将事先配制贮存的母液按顺序放好，并检查这些母液是否已变色或产生沉淀或产生结晶，已失效的就不要取用。 MS培养基母液包括大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物母液。 将洁净的各种用具如三角瓶、果酱瓶、量筒、烧杯、吸管、玻璃棒、精密pH试纸、封口膜、橡皮筋、电炉等准备好放在指定的位置。再将蒸馏水、琼脂、蔗糖、生长调节物质、1molL-1NaOH、1molL-1HCl准备好。（2）琼脂溶解根据需要配制的培养基的量称好所需的琼脂（0.0.），撕碎后放入搪瓷杯中，加入适量的蒸馏水（估计加入母液后不超过配制总量）置于电

14、磁炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动。 （3）加母液和蔗糖及定容待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放于一烧杯中），再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需要的生长调节物质，最后加蒸馏水至所需体积。（4）调PH由于培养基的pH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响。此外，琼脂培养基的pH值还影响到凝固情况。所以，当培养基配制好后应立即进行pH值的调整。最好用酸度计测试，既快又准，如无条件也可用精密pH试纸。培养基若偏酸时用lmolL-1 NaOH来调节，偏碱则可用lmolL-1 HCl来调节。一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；pH值低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。 （5）培养基的分装配制好的培养基要趁热分装，本实验用果酱瓶直接加注。每瓶2030ml，