人源化抗体制备的主要方法1.pdf

1、抗体的生物学活性抗体的生物学活性1 1 1 1）特异性结合抗原特异性结合抗原2 2 2 2）激活补体激活补体3 3 3 3）结合）结合FcFcFcFc受体受体4 4 4 4）穿过胎盘）穿过胎盘5 5 5 5）免疫调节）免疫调节SCID The recombination activating genes(RAG-1/2)required for synthesis of thefunctional Ig and TCR that characterize mature B and T cells.多克隆抗体多克隆抗体用抗原免疫动物后得到的动物血清（抗血清），是由体内分别针对抗原物质上的多个抗原

2、表位(from multiple plasma cells)，分别诱导多个不同B细胞克隆发生应答后产生的多种抗体，因此叫多克隆抗体。单克隆抗体单克隆抗体通常是指由一株B淋巴细胞杂交瘤增殖扩增而成的单一细胞克隆所产生的一种高度均一、高度专一性的抗体。Monoclonal antibody1975 with a technique devised by Khler and Milstein(for which they were awarded a Nobel Prize).They did this by literally fusing myeloma cells with antibody-

3、secreting cells from an immunized mouse.The technique is called somatic cell hybridization.The result is a hybridomaThe result is a hybridomaThe result is a hybridomaThe result is a hybridoma(NS-1NS-1NS-1NS-1).NS-1 是穩定的小白鼠 BALB/c 癌細胞株，除了能在培養基中永續生長外尚有一重要特性，細胞缺乏兩種核酸代謝重要酵素 TK,thymidine kinase HGPRT,hyp

4、oxanthine-guanine phosphoribosyl transferasepurinesHAT mediumHAT mediumHAT mediumHAT medium because it contains:hypoxanthine aminopterin the pyrimidine thymidineThe logic:The logic:The logic:The logic:Unfused myeloma cells cannot grow because they lack HGPRT.Unfused normal spleen cells cannot grow i

5、ndefinitely because of their limited life span.Hybridoma cells are able to grow indefinitely because the spleen cell partner supplies HGPRT and the myeloma partner is immortal.B cellmyelomafusionHAT ELISAELISAenlarge culture抗體生產：1)可把挑選出來的融合細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然後以針頭收集所產生的腹水，通常可取15mL 左右；腹水中的抗體濃度非常高，每 mL 可達數

6、 mg。2)把融合細胞在大型培養槽中培養，收集培養液上清即得抗體，但每 mL 只得約數 mg，濃度較腹水稀約一千倍。最近有一種細胞培養瓶，可產生如腹水般濃度的上清，但價格極為昂貴(IBS Integra Bioscience:Integra Celline)。3)得到穩定的抗體後，通常要再以 ELISA 方法 檢定該抗體的 subclass 是屬於 IgG,IgM 或 IgA 等。免疫時間太短的，較可能取得 IgM，但一般仍以 IgG 較多，注意 IgG 又可分成幾種 sub-subclass。4)所得到的抗體再經純化步驟，以除去雜質，可用下列各種方法的組合 硫酸銨分劃：收集約 40%飽和度的

7、沉澱，是最經濟、方便的方法。離子交換法：用 DEAE 陰離子交換法，多用在純化 IgG。膠體過濾法：以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化 IgM。親和層析法：以 Protein A-吸著劑 專一性地吸住抗體分子(IgG)。To achieve this end,we raised monoclonal antibodies against the KcsA K+channeland selected clones on the basis of their abilityto recognize the tetrameric but not the monomericform of the

8、 channel.抗体的检测1.ELISA用于检测针对可溶性抗原(蛋白 质)和细胞表面抗原的mAb。2.FACS(流式细胞仪)用于检测细胞表面抗原的mAb。3.用western blot检测单抗的特异性。杂交瘤细胞的克隆化克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑

9、制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突突变或染色体丢失变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释法有限稀释法和软琼脂平板法。单抗制备过程的影响因素A.污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。B.融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素PEG有毒性或作用时间过长。牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。骨髓瘤细胞污染了支原体。HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。C.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体：融

10、合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。D.杂交瘤细胞难以克隆化：可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。单克隆抗体的应用（1 1）沉淀反应：）沉淀反应：Precipitation reactionPrecipitation reaction（2 2）凝集实验：凝集实验：hae

11、maglutinationhaemaglutination（3 3）放射免疫学方法检测免疫复合物）放射免疫学方法检测免疫复合物（4 4）流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离。流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离。（5 5）ELISA ELISA 等免疫学检测等免疫学检测（6 6）BIAcore biosensor:BIAcore biosensor:检测检测Ab-AgAb-Ag或与蛋白的亲和力或与蛋白的亲和力 。(7)(7)免疫印记（免疫印记（western blotting)western blotting)（8 8）免疫沉淀：免疫沉淀：（9 9）亲和层析：分离蛋白质亲和层析：分离蛋白质（1

12、010）磁珠分离细胞磁珠分离细胞（1111）临床疾病的诊断和治疗；）临床疾病的诊断和治疗；人源化抗体（humanized antibody）抗体药物市场巨大，前景广阔。应用领域：抗肿瘤、抗自身免疫病、抗感染为主。开发类型：人源化及全人为发展方向。抗体药物在应用中存在的问题：一般必须用小鼠骨髓瘤制备单抗，故所得鼠源性单抗，必须人源化，在临床上可减少异源性蛋白所引起的过敏反应和增加疗效。鼠源抗体人源化后，抗体效价明显降低，导致临床疗效降低。临床治疗需要大量的抗体(克级），故需要生物反应器制备抗体。由于抗体的产量和质量受到限制，而影响疗效。基因工程抗体的优点和缺点优点：不受动物品系（species)

13、和抗体类型（isotype)的限制。利用嵌合抗体，使鼠源抗体人源化，减少潜在的抗原表位，增强抗体的疗效。全人源化抗体，可以降低抗体的异源性和免疫源性，最大化提升抗体的的疗效。缺点：抗体的亲和力减弱，与完整抗体结构相比，功能明显降低。目前单抗用作治疗药物的研究趋势为：1.寻找新的分子靶点；2.抗体的人源化；3.偶联物分子的微小化；4.单抗药物的高效化；5.双特异性抗体以激活宿主效应细胞；6.改变某些氨基酸以增加抗体的亲合力；7.抗体导向的酶活化前体药物技术。目的：减小鼠源性成份，降低HAMS反应（human against mouse syndrome)。易于大规模生产和应用于临床。保留抗体的抗

14、原结合能力。基本原理：借助基因工程手段，将编码Ab的重轻链可变区基因重组到真核表达载体上并进行表达。基因工程抗体的分类1.人源改造抗体（1）嵌合抗体（chimeric antibody）（2）人源化抗体（humanized antibody）（3）完全人源抗体2.小分子抗体（1）Fab片段（2）单链抗体（single chain antibody，scFv）、双链抗体、三链抗体（3）微型抗体（minibody，两个scFv与抗体CH3区连接）（4）双特异性抗体（diabody）（5）其他形式抗体（细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体、最小结合单位等）基因工程抗体制备的主要方法：1.1.1.1.人鼠

15、嵌合抗体（人鼠嵌合抗体（Chimeric AntibodiesChimeric AntibodiesChimeric AntibodiesChimeric Antibodies）原理：利用基因重组技术，把鼠抗体的重轻链可变区部分与人抗体重轻链恒定区的进行重组，减少鼠源结构，增加人源结构，而保持抗体与原抗原的特异性结合。缺点：鼠抗体部分亦能作为一种异种抗原，多次反复使用在人体产生抗体及过敏反应（HAMS反应，human against mouse syndrome)。嵌合抗体可保持特异性结合和外源性抗原降低，但亲和力明显下降。杂交瘤细胞株获得两个可变区克隆载体(T载体)原核表达系统检测构建表达载

16、体RT-PCR酶切测序酶切，连接转化是是否否酶切，连接1 1 1 1。获得鼠单抗重轻链可变区的基因片段。获得鼠单抗重轻链可变区的基因片段。2.2.2.2.基因片段插入含有人基因片段插入含有人IgGIgGIgGIgG重轻链恒定区的表达载体。重轻链恒定区的表达载体。2.humanized antibodies2.humanized antibodiesHumanization or reshaping of murine antibodies is an attempt to transfer the full antigen specificity and binding avidity of murine monoclonal antibodies to a human antibody by grafting the murine complementarity determining regions(CDRs)onto a human variable region framework。SDR graftinga new approach to antibody humanizat