qPCR原理及应用_精品文档.pdf

1、实时荧光定量PCR的原理和应用2010.10 雅睿生物 黄宝福目录 实时荧光定量PCR原理PCR荧光标记绝对定量和相对定量 实时荧光定量PCR应用 实时荧光定量PCR发展digital PCR,qPCR Array实时荧光定量PCR原理聚合酶链式反应Polymerase chain reaction(PCR)1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PC

2、R，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪聚合酶链式反应Polymerase chain reaction(PCR)1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链结合引物子链延长PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTA

3、TCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链结合引物子链延长GGAUCG5AUCGCG533DNA聚合酶DNA聚合酶PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链结合引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR原理1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变

4、性形成2条单链子链延伸DNA加倍模板DNA第一轮扩增第二轮扩增第三轮扩增第四轮扩增第五轮扩增实时荧光定量PCR在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利，利用荧光信号累积用荧光信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。量分析的方法。实时荧光定量PCR和常规PCR常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线

5、的分析对起始模板进行定量分析。荧光PCR特点灵敏度高灵敏度高特异性强特异性强全封闭全封闭PCRPCR过程，无需后处理过程，无需后处理即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量定量范围宽，可达到定量范围宽，可达到1010个数量级，无须稀释样品个数量级，无须稀释样品可实现一管多检可实现一管多检仪器自动分析，更快获得结果仪器自动分析，更快获得结果实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR原理CtCt值的定义值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t)value Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信

6、号量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性实时荧光定量PCR原理-定量原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率实时荧光定量PCR原理-定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:lg M=lg X0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:lg X0=-Ct lg(1+Ex)+lg M

7、(3)LgLg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值域值的循环数即的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。就可计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理-定量原理 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。1516171819202122232425262728293031323334353637383940110100100010000100000100000010000000C(t)ValueC(t

8、)ValueCopy NumbersCopy NumbersStandard CurveStandard Curve实时荧光定量PCR原理-相对定量XCt=X0(1+Ex)Ct,x=KxRCt=R0(1+ER)Ct,R=KRXCtRCtX0(1+Ex)Ct,xR0(1+ER)Ct,RKxKRK=X0R0(1+E)Ct,x-Ct,RK=(1+E)CtK=XNXNX0R0=Ex=ER=E:(1+E)-CtK=XN(1+E)-Ct,qK=XN,q(1+E)-Ct,cbK=XN,cb(1+E)-Ct Ct=Ct,q-Ct,cb样本q的XN除以校准样本（Calibrator）cb的XN：参比内标：靶核酸

9、：Ct,x-Ct,R：Ct=实时荧光定量PCR原理-相对定量Livak&Schmittgen,Method,2001,25:402-408绝对定量和相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）病毒病毒DNA或或RNA的拷贝数的拷贝数转基因的拷贝数转基因的拷贝数相对定量：计算初始反应模板的相对含量相对定量：计算初始反应模板的相对含量差异表达分析差异表达分析芯片评估芯片评估转基因生物的检测转基因生物的检测基因型检测基因型检测荧光标记非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：1、SYBR Green 2、EvaGreen3、LC Green特异性荧

10、光标记：特异性荧光标记：2、TaqMan3、Molecular Beacon4、AmplisensorQQRSYBR GREEN ISYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。SYBR Green SYBR GREEN 熔解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)-dIdTTmSYBR GREEN 熔解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，有杂峰其他产物出现非特异性荧

11、光，因此定量不准确非特异性产非特异性产物物SYBR GREEN法优缺点 对DNA模板没有选择性-适用于任何DNA 使用方便-不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜优 点 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件 对引物特异性要求较高缺 点FRET当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移（低能量）的荧光

12、基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),(FRET),实际相当实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。Taq man探针与目标序列互补 5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光（荧光共振能量转移原理，FRET）Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针Taq man 探针 特异性荧光特异性荧光双标记探针双标记探针 Taq酶酶5 533外切外切酶活性酶活性Taq man 探针法优缺点 对目标序列的高特异性-阴性结果确

13、定 设计相对简单-与目标序列某一区域互补重复性比较好优 点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺 点Molecular Beacon 分子信标标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂Molecular Beacon 分子信标Molecular Beacon 分子信标高特异性：高特异性：对目标序列检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低荧光背景低优 点只能用于一个特定目标设计困难价格比较高缺 点高分辨率熔解曲线High resolution melting cure(HRM)Reed et al.Pharmacogenomics(2007)8(

14、6),597608实时荧光定量PCR应用实时荧光定量PCR应用基因扩增扩增特异性分析基因定量分析基因检测基因分型SNP分析RFLP多态性分析单/多基因表达研究高通量基因表达谱研究疾病的早期诊断 免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均长达70天，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。病原体检测：确定病原体的种类和基因型，以利于治疗方案的确定遗传疾病的早期诊断 荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、插入突变、多

15、基因突变等的检测，对产前诊断具有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。药物研究 任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价其疗效均不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和动态变化来评价疗效，则较为直接和理想。新药筛选：药物作用靶标的研究，基因表达的变化 药效的评价：对服药后体内基因表达或病原体载量的变化进行监控，更好的评价药效，有助于治疗方案的改进肿瘤的诊断可对原癌基因的突变和易位等作出检测；可对原癌基因的mRNA进行定量分析；有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断；探索癌变发生机理的研究提供参考；区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。食品安全 病原微生物检测：对食品中可能存在的病原微生物进行定量检测，保护人民生命安全 转基因食品检测 动物疫病检测：为防止动物疫病的传播和人畜共患疾病的控制提供检测方法实时荧光定量PCR发展Digital PCRqPCR ArrayqPCR array Gene Coponiea公司的All-in-OneTM Human Whole Genome miRNA Q-PCR Array Origene公司的TissueScan Tissue qPCR Arrays SABiosciences公司的 RT2 ProfilerTM PCR Array SystemThe EndThank You!实时荧光定量PCR原理-定量原理