酶标仪的正确认识使用及校准_精品文档.pdf

1、酶标仪的正确认识、使酶标仪的正确认识、使用及校准用及校准 贵州省临床检验中心 吴 娴 正确认识、使用酶标仪正确认识、使用酶标仪 ELISA的基本过程涉及到加样、温育、洗板和显色、比色测定等关键环节。在酶标仪未普及以前，比色测定通常使用肉眼看是否显色来判断结果，结果判断欠客观。随着医院和血站实验室条件的改善，加之，卫生部明确要求血站实验室在做ELISA测定时必须使用仪器判读结果，因此酶标仪的正确使用及校准是保持酶标仪对微孔板比色有足够的准确度和精密度，从而为实验室提供准确、可靠、客观的结果（定性项目评价）。对已有酶标仪的实验室又如何去正确使用呢？要正确使用酶标仪就必须对酶标仪的一些性能指标（测定

2、波长、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量测定软件功能等方面）有一定的了解。（一）测定波长（一）测定波长 一般酶标仪的测定波长在400750nm或800nm之间就可以满足ELISA的显色测定。目前国内常见的ELISA试剂盒使用的标记用酶均为辣根过氧化物酶（HRP），底物通常为四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD）。OPD在过氧化氢溶液存在下，经HRP作用，分别氧化为2，2-二氨基偶氮苯（DAB）和联苯醌。当pH值为5.0左右时，DAB在450nm波长处有最大吸收，当pH值降为1.0时，最大吸收波长移至492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深，常用强酸如硫酸或盐酸

3、终止反应。TMB的氧化产物联苯醌在450nm波长处有最大消光系数，如果HPR量少，H2O2和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min。因此，ELISA测定最常用的两个波长450nm和492nm。除了这两个基本滤光片外，还考虑到双波长比色的需要，还应有620nm或630nm或650nm和405nm波长的滤光片，其他滤光片可以根据自己的需要选择。在ELISA测定中常用单双波长比色：“单波长”是使用一种对显色具有最大吸收的波长进行比色测定。“双波长”则除了用对显色具最大吸收的波长进行比色测定外，同时用对特异显色不敏

4、感的波长如630nm进行测定，酶标仪最后打印出来的吸光度则为二者之差。630nm波长下得到的吸光度是非特异的，微板孔上如指纹、灰尘、赃物等所致的吸收。因此，在ELISA比色测定中，最好使用双波长，且不必设空白。如设空白，就可能会造成测定孔吸光度为负数的现象；单个空白的非特异吸收具有一定程度的不确定性，也就是每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值。（二）测定的吸光度范围（二）测定的吸光度范围 通常酶标仪的吸光度测定范围在02.5之间就可以满足ELISA的测定要求，但有些仪器可以达到04.0的范围；对酶标仪的吸光度范围不必追求大的吸收光范围，主要看在一定的吸光度范围内的线性

5、和精密度如何。（三）光学系统（三）光学系统 酶标仪的光学系统采用的是垂直光路多通道（通常为8或12通道，亦有单通道）检测，一般为硅光管或光导纤维，有的酶标仪还有一个参比通道（参比通道测定在开机时进行自我校准）。光学系统好与坏，主要看其仪器测定的精密度与测定通道之间的均一性有直接关系，单通道可以避免因通道不同所致的差异。（四）检测速度（四）检测速度 指酶标仪完成比色测定所需要的时间。检测速度快，有利于提高检测的精密度，即避免由于在测定过程中，因测定时间不同所致的各微孔间吸光度间的差异。现在的酶标仪通常在数秒内即完成测定。（五）震板功能（五）震板功能 指酶标仪在对ELISA板孔进行比色测定前对其振

6、荡混匀，使其微孔内颜色均一。目前大部酶标仪均有震板功能，所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋转等方式震板，振荡幅度有强、轻微、不震荡。（六）温育功能（六）温育功能 指酶标仪本身能按要求自动精确地控制仪器的温度，使得ELISA测定中微孔板条的温育过程在仪器内部完成，而无需在外配温箱。目前少有部分酶标仪具有此功能，温育功能只是酶标仪的一个附加功能，是否具有并不能说明酶标仪档次的高低及仪器的优劣。（七）软件功能（七）软件功能 指酶标仪对ELISA定性和定量测定及其他测定方式如酶标动力学、紫外和凝集等测定数据具有统计分析并报告结果的功能。软件功能是中高档酶标仪的一个非常重要的功能。如果硬件方面区

7、别不大，则软件就成为判定酶标仪优劣的唯一指标。好的软件功能，对实际工作会有较大的帮助。ELISA定性测定，如酶标仪具有阳性判断值（cutt-off）及其测定“灰区”（即指测定吸光度处于cutt-off周围的一定区域，此区域内结果应为“可疑”）的统计计算功能，不但方便于实验室工作人员的结果统计，而且对某些样本结果判读有很高的实用价值。血站实验室筛检献血人员血进行HBsAg、抗HCV等的ELISA测定时，常会遇到测定吸光度处于cutt-off附近但又低于cutt-off值的血，按照试剂盒说明书的标准，可判为阴性，血为合格，可用于患者输血，但工作经验告诉我们，这样的血如果输给患者，会导致输血后感染疾

8、病的可能性较大。那么我们为什么要设定“灰区”呢？主要由ELISA现有的测定技术的不确定性造成的，也就是ELISA测定的“灰区”的存在使得ELISA测定试剂盒cutt-off的设定只是相对的准确，此时的假阳性和假阴性出现的可能性较低。因此，在血站以测定“灰区”的下限作为判断献血人员血筛检不合格为标准，就可以避免因“灰区”所致结果判断错误而引起输血后疾病发生的可能性。（八）语言界面（八）语言界面 通常进口的中高档酶标仪人机对话多采用英文。这对实验室可能会存在语言方面的困难，从而难以最大限度地发挥酶标仪的作用。综上所述，酶标仪的最基本功能就是比色测定，其基本要求就是在一定吸光度范围内要有好的测定准确

9、性、线性和精密性。同样的，吸光度范围，测定的准确性、线性和精密性越好则酶标仪亦越佳。而且，由于用于酶标仪比色测定为多孔微孔板条，为保证测定的孔间重复性，则测定速度也是一个重要的性能指标。至于其他如震板、温育及有关的软件功能，则可根据各自实验室的需要选择。酶标仪的校准酶标仪的校准 （一）酶标仪的校准（或自检）：从酶标仪相关信息资料获得一些理性认识，如果还想获得对某一酶标仪的感性认识，可以从以下几方面对其进行校准（或自检）。1、外观、外观 酶标仪上应有仪器名称，型号，编号，生产厂家，出厂日期和电源电压；各调节旋钮，按键和开关均能正常工作，外表面无明显机械损伤；显示文字应清楚完整。2、酶标仪的稳定性

10、、酶标仪的稳定性(漂移漂移)选用492nm波长，在吸光度0.0A处，测定标准值为1.0A的光谱中性滤光片(测定操作按仪器说明进行)，记录仪器示值或均值，10min后再次记录仪器示值或均值，前后两次测定值之差不应超过0.005A。3、吸光度测定的准确度、吸光度测定的准确度 选用405，492和620 nm波长，以空气为参比，分别测定标准值为0.5和1.0A的光谱中性玻璃滤光片，用专用测试板代替酶标板，按仪器说明连续测定3次，按下式计算准确度：A13(A1+A2+A3)A：(A：为标准值)。4、吸光度测定的重复性、吸光度测定的重复性 选择405，492和620 nm波长，在酶标板第一排加注空白溶液

11、，第二排加入浓度为200ugml的重铬酸钾溶液，重复测定5次。记录每次测定的第二排吸光度值，取第二排任一孔吸光度值与各次对应孔吸光度值。按下式计算重复性 maxAi-1/5(A1+A2+A3+A4+A5)A=1/5(A1+A2+A3+A4+A5)5、酶标仪的线性、酶标仪的线性 选用540nm波长，将标准值0.5，1.0A中性滤光片分别放入专用测试板样本位置中，以空气为参比，各重复测定3次；然后将以上两片中性滤光片叠加后置于专用测试板的同一孔位中，重复测定3次。线性误差：A1+A2+A1，2 aA=100%A1+A2 式中A1为第一片中性滤光片吸光度均值，A2为第二片中性滤光片吸光度均值，A1,

12、2为两片中性滤光片叠加后的吸光度均值。6 测定速度的检定测定速度的检定 选用492nm波长，放入96孔酶标板进行测定，用秒表计测仪器打印出全部数据的时间。酶标仪除了在选购时，应尽可能自检，但在使用中也要定期检定，以保证酶标仪测定的有效性。检定与校准检定与校准 1 定义定义 检定：查明和确认计量器具是否符合法定要求的程序，它包括检定：查明和确认计量器具是否符合法定要求的程序，它包括检查、加标记和（或）出具检定证书。检查、加标记和（或）出具检定证书。首次检定：对未曾检定过的新计量器具进行的一种检定。首次检定：对未曾检定过的新计量器具进行的一种检定。后续检定：计量器具首次检定后的任何一种检定。后续检

13、定：计量器具首次检定后的任何一种检定。强制性周期检定：强制性周期检定：按时间间隔和规定程序进行按时间间隔和规定程序进行 修理后检定修理后检定 周期检定有效期内的检定：由用户提出或由于某种原周期检定有效期内的检定：由用户提出或由于某种原因使有效期内的封印失效而进行的检定。因使有效期内的封印失效而进行的检定。检定通常是进行量值传递、保证量值准确一致的重要措施。检定通常是进行量值传递、保证量值准确一致的重要措施。检定与校准检定与校准 1 定义定义 校准：在规定条件下，为确定测量仪器（或测量系统）所校准：在规定条件下，为确定测量仪器（或测量系统）所指示的量值，或实物量具（或参考物质）所代表的量值，指示

14、的量值，或实物量具（或参考物质）所代表的量值，与对应的由标准所复现的量值之间关系的一组操作。与对应的由标准所复现的量值之间关系的一组操作。校准结果既可给出被测量的示值，又可确定示值的修正值；校准结果既可给出被测量的示值，又可确定示值的修正值；校准也可确定其他计量特性，如影响量的作用；校准也可确定其他计量特性，如影响量的作用；校准结果可以记录在校准证书或校准报告中。校准结果可以记录在校准证书或校准报告中。校准是在规定条件下，给测量仪器的特性赋值并确定校准是在规定条件下，给测量仪器的特性赋值并确定示值误差，将测量仪器所指示或代表的量值，按照比示值误差，将测量仪器所指示或代表的量值，按照比较链或校准

15、链，溯源到测量标准所复现的量值上。较链或校准链，溯源到测量标准所复现的量值上。检定与校准检定与校准 2 检定与校准的相同之处检定与校准的相同之处 都是计量器具的评定形式，是确保仪器示值都是计量器具的评定形式，是确保仪器示值正确的两种重要的方式。正确的两种重要的方式。都属于计量范畴。都属于计量范畴。检定与校准检定与校准 3 检定与校准的不同之处检定与校准的不同之处 3.1 目的不同目的不同 检定检定对测量仪器进行对测量仪器进行强制性强制性全面评定，评全面评定，评定计量器具是否符合规定要求，作出是否合定计量器具是否符合规定要求，作出是否合格的结论。格的结论。是自上而下的量值传递过程。是自上而下的量

16、值传递过程。校准校准对照计量标准，评定测量仪器示值的对照计量标准，评定测量仪器示值的准确性，同时可将校准结果（修正值或校准准确性，同时可将校准结果（修正值或校准因子）用于测量过程中。因子）用于测量过程中。是自下而上的量值溯源过程。是自下而上的量值溯源过程。检定与校准检定与校准 3 检定与校准的不同之处检定与校准的不同之处 3.2 对象不同对象不同 检定检定我国计量法明确规定的强制检定的计量器具。我国计量法明确规定的强制检定的计量器具。中华人民共和国计量法中华人民共和国计量法第九条第九条 县级以上人民政府计量行政部门对社会公用计量标准器具，县级以上人民政府计量行政部门对社会公用计量标准器具，部门和企业、事业单位使用的最高计量标准器具，以及用部门和企业、事业单位使用的最高计量标准器具，以及用于贸易结算、安全防护、医疗卫生、环境监测方面的列入于贸易结算、安全防护、医疗卫生、环境监测方面的列入强制检定目录的工作计量器具，实行强制检定。未按照规强制检定目录的工作计量器具，实行强制检定。未按照规定申请检定或者检定不合格的，不得使用。定申请检定或者检定不合格的，不得使用。校准校准强制性检定之外的计量