ITC200现场培训课程.pdf

1、January 2012 1 GE Healthcare Life Sciences MicroCalTM iTC200 现场培训教程 培训内容 ITC的基本介绍 ITC的基本实验流程 DEMO实验 数据分析 维护保养 等温滴定量热法(ITC)的介绍 January 2012 3 微量热技术的种类 两大主要技术两大主要技术 MicroCal iTC200 MicroCal Auto-iTC200 MicroCal VP-Capillary DSC MicroCal VP-ITC MicroCal VP-DSC 差示扫描量热法 (DSC:Differential scanning calorim

2、etry)等温滴定量热法 (ITC:Isothermal titration calorimetry)工作原理 参照校准加热器 样品池主加热器 样品校准加热器 DP 样品样品 DP是为维持零温度差异所测得的参照池和样品池间的功率差异 DT0 DP=Differential power T=Temperature difference 参照参照 工作原理：滴定前 参照池 5uW 5uW 样品池 缓冲液 样品 工作原理：滴定时 5uW 2uW 3uW 参照池 样品池 进行 ITC 实验 “配体”放在进样针中 “大分子”放于样品池 测量反应热 单次ITC 实验所能得到的参数 亲和力(KD)反应热(H

3、)结合位点的数目(N)Reference cell Sample cell Syringe ITC实验的基本原理 原始数据积分；将热量进行积分并运用合适的结合模型得到；亲和力(KD),化学计量比(N)和反应焓变(DH);通过热力学公式，计算得到反应熵变(DS)。基于热量检测的通用技术-4-2 0 0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.00.51.01.52.0-4-20 Molar Ratiokcal/mole of injectantDH N KD kcal mol-1 of injectant Molar ratio cal s-1 Time-KD:Affinity N:Stoichio

4、metry DH:Enthalpy DS:Entropy MicroCal iTC200 用等温滴定量热法能 二次筛选/hit 验证中快速得到 KD 值 测量靶点活性 确认药物与靶点的结合 用热力学指导先导化合物的优化 研究作用机制 确认 IC50 和 EC50 值 测定酶动力学 MicroCal Auto-iTC200 MicroCal VP-ITC iTC200的实验基本流程 January 2012 19 清洗机器 实验参数设定 开始实验 样品准备 iTC200的基本实验流程 清洗机器 保证滴定物与被滴定物间的缓冲液保持完全一致 pH，盐浓度，DMSO浓度 同一缓冲液中透析或者置换大分子

5、和配体 若配体太小无法透析，用蛋白透析液配置（eg.小分子或者多肽）准确测量浓度 用A280准确测量蛋白浓度 尽量准确地称取配体。若配体带发光基团，使用UV测定浓度 适用于广泛的缓冲体系 几乎所有的缓冲液，如HEPES，PBS，glycine，acetate等均可使用 如需使用还原剂，最好使用：TCEP（Tris(2-carboxyethylphosphine)hydrochloride）-巯基乙醇（-mercaptoethanol，BME）21 样品准备 清洗样品池和进样针 实验 Cell Wash 22 Syringe Wash Cell and Syringe wash 用20%Cont

6、rad 70TM（14%Decon 90TM）清洗 实验参数设定 需要多少样品？你是否知道大概的KD?Estimated KD M Protein M Ligand M Protein/KD=C 20 0.5-2 20 200 10-40 2-10 50 500 5-25 10-100 30 40*KD 0.3-3 100 30 20*KD 0.3 是是 按照表格进行 NoNo 尝试20 M 蛋白和 200 M 配体 C=10-100 最优 C=5-500 好 C=1-5 和500-1000 能接受 C=1000 竞争 ITC 0.00.51.01.52.0-16-14-12-10-8-6-4

7、-20Molar Ratiokcal/mole of injectantC=0.05 C=0.5 C=5 C=50 C=500 C=Protein/KD 实验参数设定 C值 如何使用C-value和KD Simulated binding isotherms for various c values.假设KD 为 1mM n=1 选择 C-value 等于 40 样品池样品浓度=c-value*KD/n 样品池样品浓度=40*0.000001/1 样品池样品浓度=4 x 10-5 M=40mM 配体浓度 滴定配体浓度=10-20样品池样品浓度 体积：典型 2 l(范围0.1-38 l)-初始0

8、.5 l，随后18*2 l 持续时间：4 s 间隔:典型150 s 滤过时长:5 s,用于平均数据的数据采集时间跨度 参考功率:5 to 10 cals/sec 搅拌速度:1000 rpm 反馈:高 实验参数设定 典型实验参数 应该在和滴定实验相同的实验条件下，将配体溶液滴定到缓冲液中 千万不要忘记DMSO的影响，如果在缓冲液或者母液中被使用，DMSO浓度不匹配，会有很大的放热。实验参数设定 参考实验的设定 DEMO实验 January 2012 29 目标 上手练习 演示如何在MicroCalTM iTC200上设置和运行一个滴定实验 5mM CalCl2滴定0.4 mM EDTA(10 m

9、M MES buffer,pH 5.6)，测定相互作用的KD，DH和DS 31 DEMO实验 1.实验参数设置 32 DEMO实验 1.实验参数设置 33 DEMO实验 2.预计的结果 原始数据 积分后数据 5 mM CaCl2滴定MES缓冲液，相同设置 January 2012 34 DEMO实验 3.对照实验 数据分析 January 2012 35 目标 演示如何检查数据 演示如何扣减参照热 演示如何用1:1结合模型拟合数据 了解从ITC数据中如何测定KD,N,H 和S 数据分析 样品准备 实验 数据分析 实验优化 数据分析步骤 1.导入数据 2.检查数据 3.调节浓度，基线，稀释热量

10、4.模型拟合 5.最终图片 用 Origin 软件分析数据 1.隐藏文本框 2.读数据 选择滴定和对照数据 1.选择滴定和对照数据 2.点击 Add File(s)3.点击 OK 查看原始数据 点击 Raw data 查看原始数据 基线位置ok 对照的热量很小且可重复 层控制 查看每次滴定的热量 激活 文件名 后单击 查看 2nd 滴定的热量 第2滴的热量 返回原始数据 点击 RawITC 层控制 从层中移除数据 重设显示刻度范围 重设刻度范围 然后 激活文件名然后点击 确定平均参照热 1(2)选中 NDH 列-排除第1个数据点 点击 Statistics on columns 确定平均参照热

11、 2(2)复制平均参照热数值 查看校正后的结合热 点击 DeltaH 结合热 用层控制移除参照数据 移除第1个数据点并扣除参照热 1.移除第1个数据点 2.使用 Simple Math扣减平均参照热 53 将前面复制的平均参照热数值粘贴在此处，点击OK 在方框中填-号 使用Simple Math扣除参照热 拟合数据 1.拟合到 one set of sites 模型 2.反复多次以提高拟合 3.查看Chi2，当此数值不再变化时，点击done，拟合结束 拟合后数据 N=0.86 KD=1/KA=16 nM H=-14.66 kcals/mol 仪器维护 大纲 维护概述 常规的用户维护 实验后如何

12、处理 MicroCal ITC 系统，处理后的状态?如果没有进行常规维护会发生什么?我什么时候可以呼叫维修工程师?仪器维护 为什么?仔细和彻底的维护对MicroCal ITC系统的性能是必要的 样品池的清洁对数据质量有重要影响 许多报告的“问题”源自不良的机器维护 不良的机器维护可能影响重复性 按照推荐的维护程序进行系统维护按照推荐的维护程序进行系统维护!仪器维护 如何做?2个层次的日常维护 常规的用户维护 预防性维护操作(GE Healthcare维修工程师完成）需要的材料 20%Contrad 70 或者14%Decon 90 EDTA test 试剂盒 自带零件和工具 仪器常规用户维护

13、每次运行后 每次滴定后用去垢剂清洁样品池 20%Contrad 70 或 14%Decon 90 去离子水溶液 MicroCal Auto-iTC200 系统 用PlatesPlates 自动方法或使用Detergent Clean Detergent Clean scriptscript的其他的其他方法方法 MicroCal iTC200 系统 使用 Cell and Syringe WashCell and Syringe Wash 命令 仪器常规用户维护 每周维护 用去垢剂进行彻底的样品池清洗 20%Contrad 70 或 14%Decon 90 去离子水溶液 MicroCal Aut

14、o-iTC200 系统 用去垢剂 在60 C 浸泡1小时 选择 SystemSystem 标签里的Clean Clean Cell Cell 按钮或用Plates Clean Plates Clean 自动方法运行1个实验 MicroCal iTC200 系统 用去垢剂 在60 C 浸泡30 分钟 执行 Detergent Soak and Rinse Detergent Soak and Rinse(long)(long)命令 用蒸馏水重新充满参比池 每 300 循环更换活塞头 仪器常规用户维护 每月维护 仔细检测加样针的玻璃是否破裂 如有任何损坏迹象立即更换进样针 更换活塞头 每月或每30

15、0个循环更换 每月清洗进样针（或者反相滴定（蛋白放于折射器中）后）作为预防性维护：MicroCal Auto-iTC200 系统 自动化模式下用Pipette Clean with Detergent Pipette Clean with Detergent script 设立方法 e.g.Plates Syringe Plates Syringe CleanClean MicroCal iTC200 系统 将 2 x 100 l 的 20%Contrad 70(or 14%Decon 90)吸入到注射器，然后用Accessory Accessory StationStation 上的Syri

16、nge Syringe rinse rinse long long 方法用清水冲洗 MicroCal iTC200 系统的诊断步骤 1.使用清洗模块执行CellCell WaterWater RinseRinse (Long(Long)2.用水充满样品池和参比池 3.彻底清洁滴定针 4.用水充满进样针 5.点击RealReal TimeTime PlotPlot 标签中的ExtendedExtended DataData ModeMode激活激活扩展数据模式，以包括所有MicroCal iTC200 系统产生的数据 6.执行至少15次 2 l的水滴水滴定 7.将水滴定文件发送给当地的应用专家 MicroCal Auto-iTC200 系统的诊断步骤 1.充满参比池 2.更换活塞头 3.点击RealReal TimeTime PlotPlot 标签中的ExtendedExtended DataData ModeMode激活激活扩展数据模式，以包括所有MicroCal Auto-iTC200系统产生的数据 4.执行2次水滴水实验，每次包括至少15次的2 l的滴定。第1次用platespla