FlowJo中文使用说明书.pdf

1、I FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 FlowJo中文实中文实用手册用手册（软件版本：（软件版本：FlowJo7.6.5 2012/06/20 更更新新）第一章 FlowJo简介.1 一、FlowJo对电脑配置的要求.1 二、FlowJo的安装过程(Windows).1 三、FlowJo的工作台.5 第二章 FlowJo分析单标样本.6 一、由原始数据生成单参数直方图的过程.6 二、图形的输出和保存.10 第三章 FlowJo分析多色标记样本.13 一、由原始数据生成二维点图的过程.13 二、二维点图的设门原则.16 三、多色标记分析说明.16 第

2、四章 FlowJo软件荧光补偿.18 一、用FlowJo做荧光补偿并进行数据分析的步骤.18 二、FlowJo荧光补偿的具体步骤.18 三、双指数转换.24 第五章 FlowJo的批处理功能.27 一、设门分析的批处理.27 二、表格分析的批处理.32 三、图形分析的批处理.35 第六章 FlowJo分析细胞凋亡样本.43 一、细胞凋亡概述.43 二、FlowJo分析凋亡数据的过程.44 三、凋亡数据结果分析.45 II FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 第七章 FlowJo软件分析细胞周期样本.47 一、细胞周期分析概述.47 二、FlowJo分

3、析细胞周期数据的过程.48 三、细胞周期拟合的调整方法和步骤.51 四、细胞周期结果分析.53 III FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 1 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 第一章第一章 FlowJo简介简介 FlowJo是美国斯坦福大学Leonard Herzenberg（FACS机器的发明者）实验室在90年代研发的一款流式数据分析软件。FlowJo由于功能强大，简单易用，已经被领域内的科学家、实验室广泛引用；同时FlowJo也是各高影响力核心期刊引用最多的流式数据分析软件。一、一、FlowJo对电

4、脑配置的要求对电脑配置的要求 1.PC电脑：操作系统：Windows XP，Vista，Windows7 内存：512MB及以上 网络连接：使用试用序列号及联网序列号必需要有网络连接；加密狗无需网络 2.苹果电脑：操作系统：OSX10.3或者更高版本 内存：512MB及以上 网络连接：使用试用序列号及联网序列号必需要有网络连接加；密狗无需网络 二二、FlowJo的安装过程的安装过程(Windows)请到我们的网站上下载最新版本：http:/ 2 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 在此，我们下载V7.6.5 为例http:/ 将文件下载到桌面之后，就

5、可以看到FlowJo安装程序图标。双击FlowJo安装程序 屏幕上出现解压进程窗口：解压完成后出现安装窗口：选择“NEXT”3 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 选择“NEXT”选择“NEXT”选择“Install”软件自动安装。软件安装完成后显示 选择“Done”进入软件版权信息窗口 4 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 根据不同软件的授权方法，进行以下操作：a.购买的加密狗：先在电脑上插入加密狗（Dongle），然后启动FlowJo。b.购买的序列号：在序列号栏输入序列号（Serial Number

6、），然后点击Use Serial Number按钮。c.如果是初次试用，需要申请序列号：点击 Get Trial License按钮，在FlowJo官方网站申请试用序列号。收到注册邮箱里的序列号之后，将试用序列号输入序列号栏，点击Use Serial Number按钮。5 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 d.使用Demo模式：如果试用序列号已经过期，而且需要继续学习FlowJo，点击Run in Demo Mode按钮，在Demo模式下使用FlowJo提供的Demo数据进行数据分析。三、三、FlowJo的工作台的工作台 双击桌面FlowJo软件图

7、标，进入软件工作台。或者 软件工作台由菜单栏、常用工具栏、组空间和样本空间组成。6 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 第二章第二章 FlowJo分析单标分析单标样本样本 单标记样本数据常用的显示方式是单参数直方图。单参数直方图是一维数据用的最多的图形显示形式，既可以用于定性分析，又可以用于定量分析。横坐标可以是线性标度或对数标度，单位用“通道数”或者“道数”来表示，在流式检测中的含义是代表所检测的荧光或散射光的强度。纵坐标表示的是横坐标某一特定荧光强度的细胞数，有时也用相对百分比来表现。一、一、由原始数据生成单参数直方图的过程由原始数据生成单参数直

8、方图的过程 原始数据原始数据：手册中提到的演示数据,可以在flowjochina的网站上下载 选择3 color comp文件夹中的Cy5PE comp.fcs进行分析演示。将此文件夹存放到桌面。1.双击桌面FlowJo软件图标，进入软件工作台。2.把“3 color comp”数据文件夹从桌面上拖入FlowJo。7 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 在组空间中单击选中“3 color comp”组，此时在样本空间里显示“3 color comp”组中的所有样本。在样本空间中双击“Cy5PE comp.fcs”，出现图形窗口。图形窗口显示为二维点图

9、。8 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 1)X轴选择SSC（侧向散射，侧向散射的含义：它对细胞膜、细胞质和核膜的折射更为敏感，其散射强度几乎与细胞内颗粒结构的质量成近似直线关系，也就是说，细胞内颗粒结构越复杂，质量越大，其SSC越大；反之则越小）2)Y轴选择FSC（前向散射，前向散射的含义：该值的大小与细胞的直径近似直线关系，也就说，对于不同的细胞，细胞越大，其FSC就越大；反之则越小）3)然后选择设门工具（矩形门、椭圆门、多边形门、自动门）中任意一个，在二维点图中选中淋巴细胞。如下图所示:图中用圆圈所选中区域为淋巴细胞 9 FlowJo中文实用手

10、册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 在图形窗口中双击选中的淋巴细胞，生成新的图形窗口。1)在X轴选择Cy5PE:CD4，Y轴选择Histogram，2)选择设门工具（区域门、双分门）中任意一个，在单参数直方图中设门。a.双分门设门如下图所示：左边区域为CD4阴性细胞，右边区域为CD4阳性细胞 10 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 b.区域门设门如下图所示：左边区域为CD4阴性细胞，右边区域为CD阳性细胞 二、二、图形的输出和保存图形的输出和保存 a.在单参数图上点击鼠标右键选择复制图片，可以把图片粘贴到WORD或PPT中。b

11、.在图形分析窗口菜单栏中选择“文件”并单击，选择下拉菜单中的“另存为”，选择保存位置、重新命名文件名以及保存的文件类型（SVG、PNG、EMF、JPG）。11 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 c.在FlowJo工作台单击打开布局编辑器。d.在样本空间中，把淋巴细胞的节点拖入到布局编辑器中。淋巴细胞节点如下图所示：布局编辑器显示的单参数直方图如下图所示：12 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 e.在布局编辑器中点击保存按钮，在弹出的对话框中选择保存的路径，更改保存的图片名称以及图片格式。备注：备注：可以

12、在图片名称后面直接输入需要保存的格式，比如命名并保存为：data001.JPG。可以保存的图片格式有：JPG,PNG,GIF,EMF,SVG,PDF。FlowJo默认的图片格式为PNG格式 f.更改布局编辑器输出的默认图片格式的步骤：到工作台的菜单栏中点击“编辑”菜单，在下拉列表中选择“偏好设置”，在偏好设置对话框中选择“文件格式”点击在布局编辑器项目下拉按钮，选择需要的图片格式：13 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 第三章第三章 FlowJo分析多色标记分析多色标记样本样本 多色标记样本，包含双标记、三标记及以上的样本。多色标记样本分析的原则是

13、把多色标记简化为单标记或双标记。多色标记样本在采集或数据处理过程中需要做荧光补偿。在FlowJo中的数据显示方式是二维点图。二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，横坐标和纵坐标分别代表与细胞有关的两个独立参数，平面上的每一个点表示具有相应坐标值的细胞。一般来说可以由一个二维点图得到两个一维直方图，但是由于多个细胞具有相同二维坐标现象的存在，所以二维点图的信息量要大于两个一维直方图的信息量。二维点图在设十字门之后被分成四个区域，实验目的不同，各个区域所代表的含义不同。本手册提供参考的是三标记样本的分析步骤。只要灵活掌握分析技巧，根据实验需求学会把多色分析简化，这样就可以做到事半功倍

14、的效果。一、一、由原始数据生成二维点图的过程由原始数据生成二维点图的过程 原始原始数据数据：为FlowJo演示数据，选择3-color-experiment文件夹中的931115-B02-Sample01.FCS进行分析演示。1.打开软件，将“3-color-experiment”文件夹拖入FlowJo工作台。2.在样本空间中双击“931115-B02-Sample01.FCS”样本，出现图形窗口，显示为二维点图。X轴选择FSC，Y轴选择SSC。然后选择多边形设门工具，在二维点图中选中淋巴细胞。如下图所示：14 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 3

15、.双击淋巴细胞门，出现图形窗口，X轴选择Fluor:CD3，Y轴选择FSC。使用矩形设门工具选中CD3阳性细胞，设门并命名为T细胞 15 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 4.双击T细胞门，出现图形窗口，在X轴选择Cy5PE:CD4，Y轴选择PhyEry:CD8，使用十字门工具设门，如下图所示：Q1：CD8单阳性细胞，为CD8+T细胞 Q2：双阳性细胞 Q3：CD4单阳性细胞，为CD4+T细胞 Q4：双阴性细胞 四分门更改门位置的方法：四分门更改门位置的方法：单击四分门“十字”的交点选中这个四分门，如下图所示。拖动鼠标将四分门移到目标位置。16 F

16、lowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 二、二维点图的设门原则二、二维点图的设门原则 二维点图常用四分门来设门，四分门设门要根据阴性对照界定阴性区。根据细胞分群的趋势，四分门的界定线可设在阴性、阳性细胞的分群处。三、多色标记分析说明三、多色标记分析说明 多色样本分析在实验中具有重要的地位，很多用户对多色分析感觉无从下手。其实，流式分析中结果的显示一般都是一维和二维的。因此，在流式分析中无论是几色标记的样本，只要把多色的分析简化为单标记和双标记的分析，问题就会迎刃而解。17 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-680-5527 比如：检测TREG需要标记CD4/CD25/FOXP3，可以用SSC vs.CD4的二维点图，把CD4+的细胞圈出来。然后用CD25 vs.FOXP3的二维点图，把CD25+/FOXP3+的细胞表示出来。这样就可以把CD4+/CD25+/FOXP3+的TREG细胞辨别出来。上面的实例就是把三标记的样本转化为两个二维的点图进行分析。18 FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 400-68