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1、转基因动植物第三节 转基因动植物一、转基因动物（一）转基因动物简介转基因动物指把人或哺乳动物的某种基因导入到哺乳动物(如鼠、兔、羊和猪)的受精卵里，目的基因若与受精卵染色体DNA整合，细胞分裂时，该基因随染色体的倍增而倍增，使每个细胞中都带有目的基因，使性状得以表达，并稳定地遗传给后代，从而获得基因产品。1974年，Jaenish和Mintz应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了SV40 DNA转基因小鼠。1980年，Gordon等人首先育成带有人胸苷激酶基因的转基因小鼠。尤其是1982年Palmiter等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中，获得比普通小鼠生长速度快24倍，体形大

2、一倍的转基因“硕鼠”后，转基因动物技术轰动了整个生命科学界。随后的十几年里，转基因动物技术飞速发展，转基因兔、转基因猪、转基因牛、转基因鸡、转基因鱼等陆续育成。转基因动物技术已广泛应用于生物学、医学、药学、畜牧学等研究领域，并取得了许多有价值的研究成果。（二）转基因动物培育的原理与方法转基因动物培育的基本原理是借助分子生物学和胚胎工程的技术，将外源目的基因在体外扩增和加工，再导入动物的早期胚胎细胞中，使其整合到染色体上，当胚胎被移植到代孕动物的输卵管或子宫中后，发育成携带有外源基因的转基因动物。培育转基因动物的关键技术包括：外源目的基因的制备，外源目的基因的有效导入，胚胎培养与移植，外源目的基

3、因表达的检测等。根据目的基因导入的方法与对象不同，培育转基因动物的主要方法有基因显微注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、精子载体导入法等（图1-2）。图1-2培育转基因动物的三种方法示意图1、基因显微注射法以培育转基因小鼠为例，其培育程序如图1-3。包括以下基本步骤：图1-3 基因显微注射法培育转基因小鼠示意图（1） 目的基因的制备与纯化：目的基因可以来源于：通过限制性内切酶预先分离的某一基因。逆转录法得到的cDNA。人工合成的DNA片段。聚合酶链式反应（PCR）扩增的特定基因片段。目的基因的克隆可以通过载体方式进行，通常选择质粒作为载体。将目的基因与质粒结合形成重组因子，然后转化至大

4、肠杆菌，扩增质粒，再分离纯化重组质粒DNA，用适当的限制性内切酶消化，制备成线状基因片段备用。目的基因的克隆也可以通过来实现。（2）卵供体母鼠和假孕母鼠的准备：定期准备相当数量的卵供体母鼠和假孕母鼠以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎公鼠。这些鼠的有关要求如表1-1。（3）超排卵与取卵：选择46周龄母鼠，注射孕马血清促性腺激素（PMSG）后，隔4248h再注射人绒毛膜促性腺激素（HCG），注射HCG后1013h剖腹取卵，用培养液保存，置CO2培养箱备用。（4）基因显微注射：用专门的持卵管和注射针，在显微注射仪上操作，将纯化的目的基因（DNA）注射到受精卵的雄性原核内（雄性原核较雌性原核大）。（5）

5、受精卵移植：转基因受精卵在单细胞至桑椹胚阶段移植到受孕后0.5d的假孕母鼠的输卵管，在囊胚期则移植到受孕后2.5d的假孕母鼠子宫。每只假孕母鼠移植2030个转基因卵为宜。（6）目的基因的表达整合鉴定和检测：从假孕母鼠产下的幼鼠尾尖提取DNA，用PCR、Southern bolt(DNA印迹)、FLSH(荧光原位杂交)等方法在染色体及基因水平上进行整合鉴定，并通过Northern blot(RNA印迹)和Western blot（蛋白质印迹）等方法在转录及蛋白质水平上进行表达检测。经检测获得阳性Founder小鼠（首建鼠）。（7）建系：将阳性Founder小鼠与同一品系的正常小鼠交配，检测F1代

6、仔鼠的阳性率，当繁殖到阳性率为50%左右时，即基本上可以判断出外源目的基因为单一位点的整合。经扩大繁殖，从中选择外源目的基因表达效果好、适应性好的转基因小鼠进行近亲繁殖。然后从子代中选择理想的纯合子个体进行全同胞兄妹交配，建立遗传基因小鼠近交系。2、逆转录病毒感染法逆转录病毒具有有效感染和在宿主细胞DNA上高度整合的特性。因此，利用逆转录病毒作为目的基因载体，通过感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生嵌合体动物(chimeric animal)，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物。下面介绍其中几项关键步骤。（1）逆转录病毒载体的构建：常以禽类和鼠类的逆转录病毒为载体。其构建步骤包括：提取病毒未整合

7、的环状DNA。将环状DNA克隆到适当的载体中。选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除，如构建可复制型载体，则切除其他部分非结构蛋白基因，如致癌基因等。将外源目的基因克隆到载体中。转染细胞，测定外源基因的表达。（2）包装细胞：又称辅助细胞，它能为逆转录病毒载体提供包装蛋白，对逆转录病毒载体功能的发挥起着重要的作用，决定着重组病毒效价及其宿主范围。在哺乳动物，最常用的包装细胞是-2细胞株，在其染色体内整合的是除了位点的Moloney小鼠白血病毒的缺陷型基因组。（3）重组逆转录病毒感染早期胚胎： 载体转染包装细胞后，在载体中序列的作用下，将载体DNA转录的RNA和包装细胞表达的病毒蛋白包装成具有感染性

8、的重组颗粒。这时就可以收集病毒颗粒，用于转染早期胚胎，或者将胚胎顺直接加入辅助细胞培养物中共培养进行转染。经逆转录病毒载体培育的转基因动物主要是小鼠和家禽。小鼠的转染方法如下：小鼠在交配后48h处死，取输卵管，用胚胎培养液冲出8细胞胚胎。将胚胎置专门溶液中去除透明带，再用胚胎培养液洗净。用专门溶液冲洗已转染重组病毒载体的辅助细胞，与无透明带的胚胎共培养24h转染目的基因。将转染目的基因的胚胎，经手术移植到交配后2.5d假孕母鼠子宫内。产生的仔鼠经筛选、杂交获得转基因小鼠。3、胚胎干细胞介导法胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团分离出来的，能在体外培养一

9、种高度未分化的多发育潜能的细胞。它与早期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能参与宿主胚胎的发育，形成包括生殖细胞在内的所有组织；它也可以在体外进行人工培养、扩增，以克隆形式保存，因此，将外源目的基因导入ES细胞，再移入胚泡期的宿主胚胎，最后将宿主胚胎移植到假孕母鼠子宫内，便可获得由胚胎干细胞介导的转基因动物。以小鼠为例，大致过程如下：分离培养ES细胞。从确认受精后3.5d 母鼠采取胚胎，胚胎培养46d后，分离出内细胞团。然后经胰蛋白酶处理，从中分离出ES细胞，并克隆ES细胞。ES细胞基因操作。首先构建特定的外源目的基因载体，再通过电穿孔、显微注射、磷酸钙-DNA共沉淀、逆转录病毒感染等方法，将外源目

10、的基因导入ES细胞。获取囊胚期胚胎，以作为ES细胞的移植受体。通过显微操作将ES细胞注射到囊胚期胚胎的囊胚腔内，形成嵌合体。将注射过ES细胞的胚胎，移植到交配后3d的假孕母鼠子宫内，培育出转基因小鼠。4、精子载体导入法1989年，Arezzo发现同源性和异源性大分子能够穿透活的海星精子，用吸附有pSRVCAT或 pSV2CAT的精子受精后，pSRVCAT或 pSV2CAT质粒整合到卵内，并发现CAT质粒NDA基因在胚胎内获得表达。同年，Lavitrano等利用鼠附睾内的精子进行试验，观察到相同的结果，并以30%的频率得到转基因鼠。从此发展了以精子为载体的转基因动物培育技术。这一方法的独特步骤包

11、括：外源目的基因导入精子。可通过DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法等方法实现。被导入外源目的基因的精子与卵子受精。方法有人工授精、壶腹部手术授精、体外授精等。5、体细胞核移植法（1） 通过体细胞核移植技术培育转基因动物，其技术要点是：外源目的基因通过脂质体介导等方法转染动物体细胞。用DNA杂交等方法检测，选择整合有外源目的基因的体细胞作核供体。将供体核移植到去核卵母细胞进行动物克隆。1997年，英国PPL公司的Scknieke与Roslin研究所的Wilmut等联手，首次建立这一技术，并获得3只人凝血因子IX基因和新霉素抗性基因的转基因克隆绵羊，取名为“波莉(Polly)”。（2）

12、通过将逆转录病毒载体注射MII期卵母细胞培育转基因动物 其技术要点是：受精前用显微注射方法将克隆有外源目的基因的逆转录病毒载体注射入处于减数分裂中期（MII）的卵母细胞。这一方法由Anthony等首先报道。他们用此方法获得了4头乙型肝炎表面抗原基因的转基因牛。（3）通过精子头与外源DNA合并注射卵母细胞培育转基因动物 即首先将精子与外源目的基因共孵育，然后将精子头部注射入MII期卵母细胞内。经人工破损精子膜效果更佳。（三）转基因动物的应用转基因动物在生物学基础研究、医学、农业及生物工程等领域的应用，已取得有相当值的成果。1、研究基因的结构和功能及其表达与调控：转基因动物、基因剔除动物和基因替换

13、动物，都是研究基因结构与功能、基因表达与调控的常用模型。例如：利用定点整合（基因打靶）技术培育的基因剔除动物，可以研究被剔除的基因在发育过程中的功能；利用具有不同长度或不同遗传背景的侧翼顺序的外源目的基因构建的转基因动物，研究目的基因在宿主动物表达的组织特异性，可以了解基因顺式调控元件（cis-acting element）在基因组织特异性表达中的作用；将不同外源基因转入宿主动物受精卵或早期胚胎干细胞，可以观察研究目的基因在胚胎不同发育阶段的特异表达、关闭及调控机制。2、建立人类疾病动物模型（略）3、研究人类疾病基因治疗：基因治疗（gene therapy）是指将外源功能性目的基因导入病人体内

14、，通过调控目的基因表达，抑制、替代或补偿缺陷基因，从而恢复受累细胞、组织或器官的生理功能，达到疾病治疗目的的一种方法。转基因动物为人类疾病基因治疗提供了实验依据和模型。目前关于人类疾病基因治疗的策略，一是生殖细胞基因治疗，二是体细胞基因治疗。Constantini等将小鼠或人的-珠蛋白基因转入纯合突变体小鼠的受精卵，使小鼠的贫血得到了纠正。这一实验证明用转基因动物技术对遗传病进行生殖细胞的基因治疗是完全可行的。理论上讲，生殖细胞的基因治疗，可以根治遗传疾病，但由于难度大、操作复杂以及受许多社会因素（如伦理道德等）的制约，目前只限于动物实验。在体细胞基因治疗中，基因转移的途径有两条：一条是基因直

15、接注射法（in vivo），即经静脉或肌肉直接将带有外源DNA的病毒、脂质体或裸露的DNA注入患者有关组织，使其进入相应的细胞并表达。另一条是体外基因转移再回输体内的方法（ex vivo），即将患者的体细胞（如T淋巴细胞）取出在体外培养并导入外源目的基因后重新输回患者体内。转基因动物为体细胞基因治疗提供了良好的动物模型。例如：肺囊性纤维化是由于肺囊性纤维化转膜传导调节因子（CFTR）基因突变而引起的致死性遗传疾病。人为突变CFTR基因，可以建立该病动物模型用于基因治疗研究。Hyde等人用CFTR的cDNA和鲁氏肉瘤（RSV）启动子连接成融合基因，以脂质体为载体将此基因转入纯合的缺CFTR基因小

16、鼠的气管和肺泡的内皮细胞（用基因打靶技术产生缺CFTR小鼠），发现肺及气管内皮细胞的离子转运基本正常，为人类肺囊性纤维化的体细胞基因治疗进行了有意义的探讨。4、研制生物反应器，生产天然活性药物蛋白：将药用蛋白基因导入动物的受精卵或早期胚胎，培育成转基因动物，使之在动物体内（如乳腺、血液等）高效表达，生产出天然活性药物蛋白。目前已构建成人尿激酶、-干扰素、人生长激素、-抗胰蛋白酶、凝血因子IX、纤溶酶原激活物、抗凝血酶III等基因的转基因动物十几种。上海医学遗传研究所曾溢涛等，构建了人凝血因子IX的表达载体，将此载体通过显微注射转入山羊的受精卵的雄性原核，培育出转基因山羊，在山羊分泌的乳汁中检测到人凝血因子IX。