浅谈狂犬病毒的分子生物学研究进展.pdf

1、中 国 畜 禽 种 业中 国 畜 禽 种 业中 国 畜 禽 种 业中 国 畜 禽 种 业2008.10织苗替代细胞苗进行CSF免疫，以提高猪群整体CSF抗体水平。也就是说对于没有CSF发生的猪场，或者CSF发生可控的猪场，选择猪瘟细胞苗来防治就可以了。对于CSF常发猪场，也就是CSF难以控制的有CSF持续感染的猪场和对于紧急免疫的猪群，应该选用猪瘟淋脾组织苗进行预防。至于猪瘟乳兔组织苗，由于价钱较高，免疫效果和细胞苗相差不大，笔者认为不选用。5.3猪瘟疫苗的免疫剂量猪瘟淋脾组织苗免疫剂量应以不低于150RID为易，猪瘟细胞苗剂量应以不低于750RID为易，不必要盲目的再加大免疫剂量，造成养猪生

2、产上的经费投入。目前，由于猪瘟疫苗生产厂家生产的疫苗每头份的免疫剂量不尽相同，所以，在免疫前最好要了解所使用疫苗的每头份的免疫剂量，可以通过疫苗生产厂家的技术咨询电话了解，这样最为可靠。5.4猪瘟疫苗的免疫时间最好要通过对免疫抗体的监测做出决定，但多数人们采用：仔猪2225日龄首免，6070日龄二免。种母猪在断奶后配种前免疫，种公猪每年免疫2次。5.5加强疫苗的运输、保存和使用等环节上的管理这是确保疫苗使用有效性不可忽视的环节。5.6选用信誉度高的疫苗生产厂家生产的疫苗这是防止CSF免疫失败的前提，必要时可以和该疫苗生产厂家的技术服务部门进行技术咨询，进一步了解该疫苗的特点和使用方法。总之，C

3、SF的防治是一项综合性的系统工程，防治或消灭CSF不仅要坚持合理的免疫原则；还要制定对CSF的定期监测制度，随时淘汰CSF持续感染猪是CSF净化的有效手段；提高猪的福利待遇，防止其它疫病的感染也是防止CSF发生的辅助手段。狂犬病病毒（RV）是一种能引起人和动物高度致死性疾病的嗜神经病毒，在分类学上属于单分子负链RNA病毒目、弹状病毒科、狂犬病毒属。RV是具有典型的子弹状形态的包膜病毒，长170180nm，直径7580nm，具有单股负链RNA基因组，有典型的基因组结构和基因表达方式，其遗传信息是以超螺旋的核糖核蛋白复合体（RNP）的形式储存。本文主要对影响狂犬病毒致病性的因素，病毒的繁殖过程以及

4、狂犬病毒载体的应用进行简要阐述。1狂犬病毒的基因组结构RV基因组全长约12kb,相对分子质量约4.6106，包括3端的先导区、5个连续的结构基因以及5端的非翻译区共七个部分。5个结构基因的顺序是3-N-P-M-G-L-5，该顺序在RV中高度保守，分别编码核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和转录大蛋白。在各结构基因之间具有核苷酸数目不等的非转录间隔区。3端的先导RNA基因由58个核苷酸组成，富含残基A。N基因全长为1424个核苷酸(Nt)，编码一个长度为1353个Nt的开放阅读框（ORF）。P基因全长为991个Nt，其ORF为894个Nt。M基因全长为804或805个Nt，其ORF为609个Nt。

5、G基因全长为1675个Nt，其ORF为1575个Nt。L基因全长为6476或6475个Nt，其ORF为6429个Nt。5端的非转录区由56个核苷酸组成。在N-P、P-M、M-G和G-L之间的非转录间隔区的核苷酸分别是2、5、5和24-29个。另外，G基因与L基因之间有423个碱基，是RV的非编码区，为伪基因。2影响狂犬病毒致病性的因素2.1 G基因编码的糖蛋白病毒粒子表面的糖蛋白是狂犬病嗜神经性的主要决定物质，糖蛋白能够与存在于神经细胞表面的细胞受体发生特异性结合反应，从而决定了RV的神经嗜性。狂犬病特异性的神经受体有：p75神经营养因子受体（p75NTR），烟碱型乙酰胆碱受体（NAChR）以

6、及神经细胞粘附因子（NCAM），另外，磷脂、神经节苷脂及神经生长因子可能也是狂犬病毒的受体，通过病毒与受体结合使病毒固定在细胞上，之后以胞饮方式进入细胞，在糖蛋白的作用下使病毒膜与溶酶体液泡融合，浅谈狂犬病毒的分子生物学研究进展贺福合（甘肃省定西市岷县畜牧局748400）疫病防治应用42中 国 畜 禽 种 业中 国 畜 禽 种 业中 国 畜 禽 种 业中 国 畜 禽 种 业2008.10把RNP释放到细胞质中。糖蛋白氨基酸序列中氨基酸残基的突变可以降低病毒的毒力。研究发现当333位的精氨酸被异亮氨酸、谷氨酸、谷酰胺或甘氨酸替换，不管以何种剂量何种途径用狂犬病毒感染小鼠，均无致病性。因为这种突变

7、可以阻止运动神经元的感染和病毒在成神经瘤细胞培养中的传播，尤其在成年鼠中可见到高度的减毒株。值得注意的是并不是所有的333位的氨基酸的突变都能降低病毒株的毒力，Tuffereau等发现用333位氨基酸突变株免疫12日龄的乳鼠，导致乳鼠发病。Takayama-Ito等于2006年研究发现，无致病性毒株的第194位的天冬酰胺若被赖氨酸替换，能增强狂犬病毒突变株的毒力，使病毒对宿主的致病性能力提高。狂犬病毒的致病性也与糖蛋白的序列有很大关系。Mori-moto等发现，当用标准攻击毒株CVS株的G基因替换弱毒株SAD L16的G基因（SAD L16是疫苗株SAD B19的弱化株）形成SAD Gcvs病

8、毒，该病毒经肌肉和脑内途径免疫小鼠，出现狂犬病症状，但作为对照的SAD L16病毒没有症状。尽管SAD Gcvs病毒的致病性增加十分明显，但与CVS株病毒相比，小鼠发病时间延长。这表明除了糖蛋白外，还有其他的因素影响狂犬病毒的致病性。2.2细胞凋亡影响狂犬病毒致病性强弱的另一个因素就是狂犬病毒诱导细胞凋亡的能力，这种诱导能力与病毒株毒力的强弱成反比关系。Jackson等证实了有致病性的狂犬病毒侵袭中枢神经系统后能诱导神经细胞发生凋亡，说明细胞凋亡与病毒的致病机理有一定的关系。研究发现，表达细胞色素C的重组狂犬病毒，通过外周途径感染小鼠，发现病毒致病性明显降低，这是因为进入细胞浆的细胞色素C在d

9、ATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使半胱天冬蛋白酶9（Caspase-9）与其结合形成凋亡小体，Caspase-9被激活，被激活的Caspase-9能激活其它的Caspase，如Caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。单独表达狂犬病毒糖蛋白就能充分的诱导细胞凋亡。Prehaud等于2003年的研究表明，克隆狂犬病毒G基因的重组体在诱导表达系统的帮助下能诱导细胞凋亡，并且发现来源于ERA减毒株的G基因较来源于CVS毒株的G基因更容易诱导细胞发生半胱天冬蛋白酶依赖的细胞凋亡，另外，狂犬病毒减毒株能诱导涉及凋亡诱导因子AIF的不依赖半胱天冬蛋白酶的细胞凋亡

10、。以上两种细胞凋亡途径可被Bcl-2基因的过度表达所抑制，这表明Bcl-2基因的增量调节对感染细胞中的病毒具有保护作用，这是因为Bcl-2的过度表达可引起细胞核谷胱苷肽（GSH）的积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，从而降低了Caspase的活性，抑制细胞凋亡。狂犬病毒粒子的脱壳和复制是引起细胞凋亡的必不可少的因素，Kassis等发现从转染的质粒中表达的基质蛋白（M）能够诱导与上面提到的相似的细胞凋亡途径，这表明M蛋白在早期细胞凋亡中有重要的左右。虽然狂犬病毒的神经毒性与诱导细胞凋亡之间互相抑制的精确机理还不清楚，但很明显狂犬病毒抑制细胞凋亡的性质对病毒的传播具有一定的作用。2.3干扰素干扰素是

11、一种新型细胞活性因子，具有抗病毒、抗细胞增殖、调节免疫功能等特性。狂犬病毒对外源的干扰素非常敏感，病毒具有预防干扰素表达的编码机制，研究这一机制对降低病毒的致病力具有重要的作用。同属于弹状病毒科的水泡性口膜炎病毒（VSV），虽然缺乏干扰素诱导抑制物，但这却与VSV病毒M蛋白的活性有关，M蛋白能起到宿主基因表达的开关作用。狂犬病毒M蛋白不能起到类似于VSVM蛋白的作用，但P蛋白却能抑制干扰素的表达，它是通过抑制干扰素调节因子（IRF-3）的磷酸化而阻止型干扰素浅谈狂犬病毒的分子生物学研究进展贺福合（甘肃省定西市岷县畜牧局748400）应用疫病防治43中 国 畜 禽 种 业中 国 畜 禽 种 业中

12、 国 畜 禽 种 业中 国 畜 禽 种 业2008.10的转录。虽然P蛋白在病毒RNA的合成中具有重要作用，但仍可以构建出能够高效表达IFN-基因的转录和干扰素刺激基因表达的重组狂犬病毒，并且这种能够诱导产生干扰素的病毒在干扰素感受态细胞中培养是时很快消失，表明在病毒消灭过程中干扰素具有重要作用。3狂犬病毒的繁殖过程狂犬病毒糖蛋白与细胞受体结合后进入细胞，在糖蛋白的作用下，把核衣壳释放到细胞质中，病毒在细胞质中进行转录、翻译、复制，然后组装成新的病毒粒子，完成病毒的繁殖过程。弹状病毒mRNA的转录是从基因组3端启动子处发生的，连续合成单顺反子mRNA，RNA聚合酶在每个基因的边界都会发生部分的

13、解离，使得从3端到5端基因的转录产物越来越少，形成一个转录梯度。狂犬病毒5个基因间隔区的核苷酸数目不一样，使得越靠近5端的基因受间隔区的影响越大，尤其是L基因，其转录产物几乎不能被检测到。Finke等发现当用P-M、M-G、G-L之间的间隔区核苷酸替换N-P之间的核苷酸，下游基因的转录产物分别下降了22%、19%、89%，证明了基因间隔区对基因转录的调控作用，并且，间隔区越长，下游基因转录越少，相反，当用N-P基因之间的间隔区序列替换G-L基因之间的序列，发现L基因的mRNA的表达量和病毒RNA的合成都普遍增加。表明狂犬病毒演化了一套独特的调节转录机制来影响病毒的复制能力。狂犬病毒mRNA是以

14、细胞的翻译机制被翻译，大部分在细胞质中游离的多核糖体中表达。但是，G蛋白是在粗面内质网中翻译产生，再经过高尔基体被转运到细胞膜上。狂犬病毒基因组的复制是以核糖核蛋白复合体作为模板，复制是在协调因子P蛋白的参与下，由病毒RNA依赖的RNA聚合酶催化完成的。值得注意的是，M蛋白对病毒的转录复制也具有重要的调控作用。Finke等研究发现，当缺少M蛋白时，狂犬病毒的复制受到限制，基因转录效率提高，转录产物增加；当增加M蛋白时，转录效率下降，复制增加。4狂犬病毒载体的研究进展狂犬病毒在宿主体内能诱导产生高效的体液免疫和细胞免疫，故狂犬病毒作为载体在疫苗制备方面具有广泛的用途。狂犬病毒载体在保留糖蛋白作为

15、主要的保护性抗原的同时，关键是要避免病毒本身的神经致病性。降低病毒致病性目前常用的有两种途径：一是对糖蛋白主要抗原位点的氨基酸突变来降低病毒的毒力；二是通过反向遗传学技术拯救病毒，目前为止，已经拯救了3株狂犬病毒弱毒株，分别为SAD B19、HEP-Flury和RC-HL。目前，用作载体的狂犬病毒多为SAD B19弱毒株。用该载体表达艾滋病、丙型肝炎等病毒抗原的实验研究都取得了很好的效果。最近，Smith等用狂犬病毒糖蛋白作为转移载体表达炭疽保护性抗原，免疫小鼠有一定的保护效果。狂犬病毒的高致病性，使得狂犬病毒载体的使用受到质疑。但是，因为病毒在人体内的血清阳性率较低，故狂犬病毒作为载体具有很大的发展潜力。5研究展望狂犬病是全球性的严重公共卫生问题，全世界估计每年有55000人死于该病，近年来，我国狂犬病出现了第三次流行高峰，每年有将近3000人死于该病，故对狂犬病毒的研究显得尤为重要。对病毒致病性及繁殖过程中关键步骤分子机理的深入研究，有助于狂犬病毒高度弱毒株和狂犬病毒载体的合理设计，而且，对研究治疗狂犬病毒或其他负链RNA病毒的特异性抗病毒药物具有很大的帮助。疫病防治应用44