1、 石蜡切片免疫荧光操作规程 试剂 1)二甲苯 2)PBS 缓冲液 3)0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。4)goat 血清 5)一抗稀释液:3%BSA in TBS,pH7.4 操作流程 1.脱蜡和水化 脱蜡前,应将组织切片在室温中放置 60min 或 60恒温箱中烘烤 20min。1)组织芯片置于二甲苯中浸泡 10min,更换二甲苯后再浸泡 10min;2)无水乙醇中浸泡 5min;3)95%乙醇中浸泡 5min;4)70%乙醇中浸泡 5min;2.PBS 洗两次各 5min。3.抗原修复,用于福尔马林固定的石蜡包埋组织
2、芯片。煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至 95左右,放入组织芯片加热 1015min,必须等缓冲液冷却后,方能将切片取出。4.PBS 洗 5min。5.滴加 5%正常山羊血清,室温封闭 30min,甩去多余液体。6.滴加一抗,室温 1 小时或者 4过夜或者 371 小时(4过夜后在 37复温 45min)。7.PBS 洗 3 次每次 5min。8.滴加荧光标记的二抗,室温避光孵育 1h。(注意抗体针对的种属,使用浓度:Alexa488、Alexa555 为 1:1000,Cy3、FITC 为 1:200,用锡箔纸包住培养板放在抽屉中避光。)9.PBS 洗 3 次每次 5min。10.Hoechst 染色:把 1000Hoechst 用 PBS 稀释,50ul/片,染色 10min。11.PBS 洗 3 次每次 2 min。12.封片:Mounting Medium 封片,等 Mounting Medium 凝固后再拍照。