纤维素酶CMC糖化力测定方法的改进_精品文档.pdf

1、饲料检测纤维素酶CMC糖化力测定方法的改进刘国生 王 琳 李学梅 侯进怀 刘翠然河南师范大学生物系摘要 本文研究和分析了3,5 二硝基水杨酸(DNS)法测定纤维素酶羧纤维素(CMC)糖化力的实验条件,如:波长、温度、pH、酶促反应时间、DNS显色时间等。实验表明:在50、pH416条件下酶促反应时间5min,DNS显色5min,于490nm处测定OD值比较适宜,从而简化了实验操作,便于在生产中应用。关键词 DNS法 纤维素酶 CMC糖化力 在饲料、食品、发酵等行业,纤维素酶的应用越来越广泛,特别是在饲料行业,其应用呈逐年增加的趋势。纤维素酶是一种多组分的复合酶,不同来源的纤维素酶其组成及各组分

2、比例有较大差异,同时纤维素酶作用的底物也比较复杂,致使纤维素酶活力的测定方法很多,且方法复杂而不统一。常用的方法有:CMC糖化力法、CMC液化力法、滤纸糖化力法、滤纸崩溃法和棉花糖化力法等。国内许多单位分别采用了以上各种方法并进行了种种修改,使测定的方法更加多样化,造成不同产品,不同结果之间无法相互比较的局面。同时很多方法又不便于在生产中应用。上述测定方法中,CMC糖化力主要代表外切1,4葡聚酸苷酶和内切酶的活力总和,在研究和实际生产中应用比较普遍。因此本文主要对CMC糖化力方法进行了实验研究,改进了测定方法,该方法快速而简便,便于在饲料加工生产中进行纤维素酶活力的快速测定。1 材料和方法11

3、1 材料 纤维素酶由河南省生物工程中心提供112 试剂11211底物溶液:准确称取01625g羧甲基纤维素钠盐,溶于100mL醋酸钠缓冲溶液(012mol,pH416),加热搅拌使之溶解。112123,5 二硝基水杨酸显色剂(DNS显色剂):称取10g3,5 二硝基水杨酸溶于蒸馏水中,加入20g氢氧化钠、200g酒石酸钾钠和500mL水,加热溶解后再加入重蒸酚2g、无水亚硫酸钠015g,待全部溶解后冷却,定容至100mL,贮于棕色瓶中,放置一周后使用,用前过滤。11213 标准葡萄糖溶液:用蒸馏水溶解2710mg葡萄糖定容到25mL。11214酶溶液:用012mol,pH416醋酸缓冲溶液溶解

4、酶制剂,配成一定浓度的酶溶液。113 仪器 日本日立公司330分光光度计114DNS法测定纤维素酶活力 方法参见文献4,7并有改进11411 标准曲线的绘制取5支带有20mL刻度的试管,按下表量取试剂:试管号标准葡萄糖溶液(mL)醋酸钠缓冲液(012molL,pH416)试液中葡萄糖量(mol)OD490空白值051001014416214201641431630184124184110410610 每管各加1mL2mol氢氧化钠溶液和2mLDNS显色液,摇匀后置于沸水浴中,准确5min后流水冷却,蒸馏水定容至20mL,摇匀后以0号管为对照于490nm处测定各管的OD值。以葡萄糖的mol数为横

5、坐标,OD值为纵坐标,绘制标准曲线。11412CMC糖化力测定步骤及测定条件与酶活力的关系分析取3支带有20mL刻度的试管,1支管作空白对照,2支管作平行样品管。每支样品管中加1mL酶溶液,置于50(酶促反应温度)水浴锅中预热02饲料研究 1999年第1期2min,然后在3支试管中分别加入4mL已预热至50 的底物溶液,准确计时5min(酶促反应时间)取出,每管立即分别加入1mL12mol氢氧化钠溶液和2mlDNS显色液,摇匀后在对照管中再加入1mL酶液。将3支试管放入沸水浴中,5min后立即取出,流水冷却,用蒸馏水定容至20mL后,用分光光度计以空白值为参比测定OD值,以两样瓶管平均值代入下

6、式求出酶活力。酶活力计算:从标准曲线中查出葡萄糖mol数酶活力(ug)=葡萄糖量/(5Ew)5为保温时间(酶与底物作用时间,min)Ew为1mL酶液中含有的酶量(g)u为在特定条件下,每min催化纤维素水解生成1mol葡萄糖的酶量在考察每一种测定条件对测定结果的影响时,需要固定其他条件按上述条件进行实验。在上述方法条件基础上,该文主要考察了酶促反应温度、酶促反应时间、pH值和分光光度测定OD值时的波长四个主要因素。2 结果与讨论211 还原糖与DNS反应产物的最大吸收波长DNS测定的是酶对CMC的糖化力,其水解产物如纤维二糖,葡萄糖是还原糖,能将3,5 二硝基水杨酸还原为棕红色的氨基化合物,在

7、一定浓度范围内,还原糖的量与该物质溶液颜色的深浅成一定比例,可用分光光度计进行测定。用DNS法测定还原糖方法中所采用的波长有540nm,520nm,490nm等。波长不同则OD值不同,据此计算出的酶活力也差别较大。这是不同产品或不同数据之间无法相互比较的原因之一。为此,在找到对最适酶促反应条件之前,应先确定还原糖测定所用的最佳波长范围。对DNS与还原糖反应产物的光吸收特性进行了分析,其460620nm光吸收曲线如图1所示。图1DNS与还原糖反应产物的光吸收曲线 从图1曲线可知,该棕红色的氨基化合物在600470nm间都有较大的光吸收值,其最大吸收峰在480nm处,文献中采用540nm和520n

8、m波长与最大吸收峰偏离较大,相对灵敏度就较低,而如果直接于480nm处测定OD值,其数值波动较大,容易造成不同时间、不同实验室和不同仪器间重复性差的结果,而且DNS显色液本身在480nm处也有较大吸收值,对OD值测定存在干扰作用。选取490nm作为测定波长是比较合适的,这样既可避免显色液本身的背景干扰,提高灵敏度,又可达到较高重复性的目的。212 酶促反应最适pH酶对环境的酸碱度比较敏感,其催化活性直接受溶液pH值的影响,只有在适宜的pH值范围内测定出酶活大小才能真正反映出酶活的高低,故酶活的测定中pH是应考虑的重要因素之一。在纤维素酶系中,作用于底物的最适pH大多在410515之间,酶促反应

9、pH值的较为集中但又不太统一,有的为pH416,有的为pH415,有的为pH414。利用河南省生物工程中心提供的木霉纤维素酶样品,测定其酶活性与pH值之间的关系,结果如图2所示。该酶样品催化底物的最适pH值416。考虑到生产上应用的多数纤维素酶的pH在410510之间,且多在415417左右。为统一和便于相互比较,对于最适pH值在410515之间的酶样品,建议采用pH416测定酶活。而对于最适pH值不在此范围的酶样品,如碱性纤维素酶可在其最适pH值条件下测定。图2 纤维素酶活大小与pH值关系曲线213 酶促反应最适温度温度对酶促反应速度影响很大。在低温时酶促反应进行缓慢,而温度过高会使酶蛋白变

10、性失活使酶的浓度大为降低,同时酶的最适反应温度不是一121999年第1期 饲料研究个不变的常数。例如酶作用时间愈长最适温度愈低,反之作用时间愈短则最适温度愈高。用DNS法测纤维素酶活时,发现不同的厂家和单位所采用的酶促反应温度差别很大。例如:有的采用50,文献1和文献7采用40,还有的采用45 等。不同酶促反应温度所测定的酶活差异甚大,又是导致不同数据之间相互比较和交流很困难的另一重要原因。纤维素酶活随温度变化情况如图3:图3 纤维素酶活与反应温度曲线从图3中可知,在3658 之间相对酶活随着温度升高而升高,当温度在5862之间时,相对酶活性没有明显变化,曲线近似呈水平状态,在40、45、50

11、条件下,其相对酶活分别为56%、70%、80%,而当温度大于58 以上时相对酶活不再升高。其原因可能是温度偏高造成部分酶失活。考虑到大多数情况下纤维素酶作用底物的最适温度在4565 之间,所以我们认为用DNS法测定纤维素酶活时,酶促反应温度以50为宜,能更真实地反映酶活性高低。214 酶促反应时间在一定条件下,酶与底物作用时间与酶促反应速度关系非常密切。测定酶活力的一个重要原则就是测定其初速度,但初速度的测定非常不容易掌握。有时在一瞬间酶与底物的结合达到饱和,即达到最大反应速度。同时,当酶解产物达到一定浓度会对酶产生反馈抑制作用,故时间过长反而不能真正代表酶的活力。目前,在用DNS法测定纤维素

12、酶活的方法中酶与底物作用时间多采用30min、15min或10min,也有用5min的。时间过长或过短都不能准确反映样品的酶活力大小。在其他条件不变时,酶活力大小与酶促反应时间的关系如图4所示。图4 还原糖生成量和纤维素酶活力与酶促反应时间曲线 图4结果表明,酶促反应1min后,酶作用底物产生的还原糖量随时间延长呈直线上升,5min后还原糖量的增加变得比较缓慢,10min后,曲线呈水平状态,还原糖量不再增加。同时从相对酶活曲线可以看出,随着时间的延长相对酶活逐渐降低,在5min时其相对酶活降低了30%,到10min时相对酶活下降了50%,此后相对酶活无大变化。由此可见,在15min内,还原糖量

13、变化曲线呈直线上升趋势,其斜率可以代表酶促反应的初速度,同时在5min时,相对酶活为70%,所以酶促反应时间5min比较适宜,这样既缩短了测定时间,又便于饲料行业等生产中进行快速测定。总之,通过对上述条件的分析,在用DNS法测定纤维素酶活力时,我们认为在50,pH416条件下,酶促反应时间5min,DNS显色5min,于490nm处测OD值比较适宜。同时不同测定者由于测定条件的不统一其酶活单位定义也各异,例如有的定义1min水解1mol、1mmol或1g葡萄糖的酶量为1个酶活单位,也有的定义为1h水解生成1mg、1mmol葡萄糖的酶量为1个酶活单位。为了便于比较,建议在采用统一的测定方法的基础上,CMC糖化力酶活单位采用国际单位,即1min水解生成1mol葡萄糖的酶量为1个活力单位。参考文献1 刘亚力,陈宏,朱元招 1 饲料研究,1998,(2):17192 中山大学生物系生化微生物教研室 1 生化技术导论 1 人民教育出版社,19793 朱俭,等 1 生物化学实验 1 上海科学技术出版社,19814 北京大学生物系生化教研室编 1 生物化学实验指导 1 人民教育出版社,19805 张树政,等 1 酶制剂工业 1 科学出版社,1984通讯地址:河南新乡市45300222饲料研究 1999年第1期