胃肠道肿瘤冻存组织原代细胞培养的实验研究_精品文档.pdf

1、论著(应用基础研究)胃肠道肿瘤冻存组织原代细胞培养的实验研究陈光，蔡慧云，魏晓军，白雪，杜峻峰，于波(解放军北京军区总医院普通外科，北京100700)摘要:目的探讨冻存胃肠道肿瘤组织复苏后原代细胞培养的可行性方法。方法采用胎牛血清、RPMI Medium 1640 培养液、二甲基亚砜(DMSO)配制冻存液，复苏以此冻存液冷冻保存的 8 例胃肠道肿瘤组织并行原代细胞培养，另复苏 2 例未加冻存液直接冻存的胃肠肿瘤组织为对照组。结果8 例冻存液保存的胃肠道肿瘤组织原代细胞培养均获成功，成功率为 100%。对照组 2 例未加冻存液冻存的肿瘤组织培养失败。结论复苏应用冻存液冻存的胃肠道肿瘤组织进行原代

2、细胞培养可获得成功，细胞生长时间与冻存时间及肿瘤细胞恶性程度有关，采用高浓度血清冷冻保存效果较好。关键词:胃肠道肿瘤;冻存;原代细胞培养中图分类号:R 735文献标志码:Adoi:10 3969/j issn1671-3826 2011 04 01文章编号:1671-3826(2011)04-0605-03Study on primary cell culture of gastroenteric cancer tissues after cryopreser-vationChen Guang，Cai Hui-yun，Wei Xiao-jun，Bai Xue，Du Jun-feng，Yu Bo

3、(Department of General Surgery，General Hospital ofBeijing Command，PLA，Beijing 100700，China)Abstract:ObjectiveTo explore the approach of primary cell culture of frozen-thawed gastroenteric cancer tissues after cryopreser-vation Methods8 cryopreserved gastroenteric cancer specimens were thawed which w

4、ere reserved by the cryopreserved agent com-bined with fetal bovine serum，RPMI Medium 1640 and DMSO，and the control group was 2 gastroenteric cancer specimens whichwere directly cryopreserved without the cryopreserved agent Results8 gastroenteric cancer specimens which were reserved by thecryopreser

5、ved agent succeeded in primary culture，and the control group was failed ConclusionPrimary culture of frozen-thawedgastroenteric cancer tissue which was reserved by the cryopreserved agent can be carried out，the time of cell growth is related withtime of cryopreservation and malignancy degree of tumo

6、r cell，and cryopreserved with high concentration serum is more effectiveKey words:gastroenteric neoplasms;cryopreservation;primary cell culture原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，基因保留量在 90%以上，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。但由于受取材及保存方法所限无法获得大量原代细胞及进行长期动态观察。目前文献报道多为新鲜组织原代细胞培养，为此我们进行了胃肠道肿瘤冻存组织原代

7、细胞培养的实验研究以期为胃肠道肿瘤原代细胞培养提供多渠道组织来源。1材料和方法1 1材料与标本(1)冻存液配制:50%80%胎牛血清基金项目:国家自然科学青年基金(81000189)作者简介:陈光(1971-)，男，内蒙古人，副主任医师，在读医学博士通讯作者:于波主任医师，E-mail:yubo66 126 com(Hyclone 公司);40%10%RPMI Medium 1640 培养液(Gibco 公司);10%二甲基亚砜(DMSO)(Chemicon 公司)。(2)原代细胞培养工作液配制:20%胎牛血清(Hyclone 公司);80%RPMI Medium 1640 培养液(Gibco

8、 公司);100U/ml 青霉素(齐鲁制药厂);50 U/ml 庆大霉素(齐鲁制药厂)。(3)标本:8 例原代细胞培养所需标本均为本室冻存胃肠道肿瘤组织(3 例胃癌、3 例结肠癌、2 例直肠癌)，冻存时加入冻存液中保存，冻存时间为 0.5 3 个月，另取冻存时间为 0.5 个月未加冻存液直接冻存的胃癌、结肠癌组织标本各 1 例为对照。所有组织标本的取材均需事先向病人及(或)家属详细解释，征得病人及(或)家属的同意后签署 知情同意书。1 2方法1 2 1新鲜标本的冻存无菌条件下自新鲜手术标本切取肿瘤组织块，经无血清培养液清洗 3 次，修剪成约 0 5506临床军医杂志2011 年 8 月 第 3

9、9 卷 第 4 期Clin J Med Offic，Vol.39，No.4，August，2011cm 0 5 cm 0 5 cm 大小，置入装有冻存液冻存管内，70 冰箱中过夜，第 2 天放入液氮中。1 2 2原代细胞培养将冻存组织于 37 快速复温，原代细胞培养工作液清洗 3 次，尽量修剪去除纤维组织，将组织块剪成约 1 0 mm 1 0 mm 1 0 mm 大小的小块，弯头吸管吸取组织块均匀种植于 75 cm2培养瓶瓶底，瓶内加入适量原代细胞培养工作液，小心翻转培养瓶使组织块黏附于瓶底，置于 37、5%CO2培养箱中培养 6 8 h，待组织贴壁后，正置培养瓶，补加适量培养液继续培养。每日

10、定时观察细胞生长状况，记录细胞生长满瓶时间，并收集培养细胞送病理学检查。2结果8 例冻存液保存的胃肠道肿瘤组织原代细胞培养均获成功，成功率为 100%。组织块种植 48 120 h 后可见肿瘤细胞自组织块周边爬出(见图 1 5)，肿瘤细胞呈长梭形，贴壁生长良好，细胞生长满瓶时间 7 14 d(见表 1)。培养细胞病理学检查提示为腺癌细胞，可见多核细胞(见封四图 1 3)。对照组2 例胃肠道肿瘤组织14 d 后仍未见细胞爬出，培养失败。表 1冻存胃肠肿瘤组织原代培养细胞生长时间组织病理类型冻存时间(d)肿瘤细胞爬出时间(h)肿瘤细胞满瓶时间(d)胃中分化腺癌60969胃低分化腺癌30728胃低分

11、化腺癌9012014结肠中分化腺癌15487结肠中分化腺癌7512012结肠低分化腺癌30729直肠高分化腺癌409612直肠中分化腺癌309610图 1胃癌冻存组织原代培养 72h 后可见肿图 2结肠癌冻存组织原代培养 72h 后可见图 3胃癌冻存组织原代培养 120h 后可见多瘤细胞爬出肿瘤细胞爬出量肿瘤细胞爬出图 4结肠癌冻存组织原代培图 5胃癌冻存组织原代培养 9d养 7 d 后可见肿瘤细胞呈长梭后可见肿瘤细胞呈长梭形，贴壁形，贴壁生长良好生长良好，接近满瓶3讨论肿瘤细胞株由于其易于快速繁殖，可繁殖多代，操作方便，能快速且规模性的进行实验研究而受到注意和重视。但其最大缺点是只保留基因

12、30%40%，而人体的基因是网络联系的，如果中间缺了一块，那反映出来的实验结果就很难让人信服，想象一下像蜘蛛网的电路图，如果缺了一大块，那么结果肯定不一样的，所以使用高基因保留量(90%以上)原代细胞进行研究和药物筛选可以克服细胞株基因保留量少的缺点。但由于目前原代细胞培养均系采用新鲜组织，受取材及保存方法的限制，无法进行快速、规模性及动态性实验研究。利用冻存肿瘤组织进行原代细胞培养可能帮助我们解决这一问题。日本山口大学的 Fahrudin 等采用 5%DMSO 冷冻保存胎牛皮肤组织，复苏后产生了有活力的可用于核移植的细胞系，同时也证明了来源于冷冻组织的细胞系可获得与新鲜组织来源的细胞系相似的

13、体外结果1。在低于 70 的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降低至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。我们的实验研究表明，复苏冻存时间为 15 90 d 不等的胃肠道肿瘤组织行原代细胞培养可获得成功，细胞生长时间与冻存时间及肿瘤细胞恶性程度有关，而采用未加冻存液直接冻存的肿瘤组织复苏后行原代细胞培养未能获得成功，表明冷冻保护剂和血清对于冻存细胞的保护作用。防冻剂的作用是稀释溶液中的溶质浓度，减小冷冻和解冻过程中细胞渗透性损伤和606临床军医杂志2011

14、年 8 月 第 39 卷 第 4 期Clin J Med Offic，Vol.39，No.4，August，2011阻止冰晶形成，不同的组织细胞对防冻剂的反应性和敏感性不同，高浓度防冻剂也会造成细胞毒性和渗透损伤。我们应用加有50%80%胎牛血清和10%二甲基亚砜(DMSO)的 RPMI Medium 1640 培养液作为冻存液冻存组织块，采用高浓度血清冻存组织复苏后原代培养的细胞状态较低浓度血清为好，程金华、朱化彬等的研究显示同浓度 DMSO 为冷冻保护剂效果优于同浓度的甘油(P 0 05)，但添加 50%血清时并不明显(P 0 05)，可能与较高血清浓度有关，血清对冻存细胞的影响高于冷冻保

15、护剂的作用;血清浓度一定时，DMSO 和甘油浓度在 10%15%时，冻存效果较好;当甘油与 DMSO 浓度一定时，血清浓度越高冷冻保存效果越好3。总之，复苏应用冻存液冷冻保存的胃肠道肿瘤组织进行原代细胞培养可获得成功，细胞生长时间与冻存时间及肿瘤细胞恶性程度有关，采用高浓度血清冷冻保存效果较好。对于冻存时间较长的组织(超过 3 个月)能否行原代细胞培养以及冻存液中最适血清浓度、冻存组织和新鲜组织所获得的原代细胞之间有无差异等尚需进一步研究。参考文献:1Fahrudin M，Otoi T，Suzuki T Developmental competence of bo-vine embryos r

16、econstructed by the transfer of somatic cells derivedfrom frozen tissuesJ J Vet Med Sci，2001，63(10):1151 1154 2曾艳，付浩，韦星呈，等 肿瘤细胞冻存方法的探讨J沈阳医学院学报，2006，8(2):156 157 3程金华，朱化彬，孙秀柱，等 冷冻保护剂和胎牛血清对牛成纤维细胞冷冻效果的影响J 中国畜牧杂志，2006，42(21):12 14(收稿日期:2011-05-27)研究摘报糖尿病健康教育做法及体会贡瑾(解放军沈阳军区大连疗养院桃源疗区门诊，辽宁大连116013)关键词:糖尿病;健康教育中图分类号:R 587 1为使糖尿病患者及其家属了解糖尿病防治知识、掌握自我保健技能，改变不良生活方式，现将两年来在我院疗养的 80 例老年 2 型糖尿病健康教育方法及其效果总结报告如下。1临床资料1 1一般资料老年 2 型糖尿病 80 例，其中男 63 例，女17 例;年龄 60 83 岁;大学文化程度 30 例，中学 38 例，小学 12 例。1 2方法(1)教育方式:根据疗养时间集中