SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒说明书生工_精品文档.pdf

1、 SanPrep 柱式 PCR 产物纯化试剂盒 产品编号：SK8141/SK8142 包装规格：50 次/100 次 试剂盒组成试剂盒组成 组分 SK8141，50 次 SK8142，100 次 纯化套件（吸附柱+收集管）50 套 100 套 Buffer B3 24 ml 48 ml Wash Solution 12 ml 24 ml Elution Buffer 5 ml 10 ml 操作手册 1 份 1 份 保存方法及注意事项保存方法及注意事项 本试剂盒在室温（1525C）干燥保存，有效期见包装。Buffer B3 中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤

2、、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。产品介绍产品介绍 本试剂盒适用于从 PCR 反应液或各种酶促反应液中纯化回收 DNA 片段。该试剂盒采用特殊的吸附膜，能够有选择性地吸附核酸分子，去除反应液中的各种酶蛋白、引物、dNTP 等，得到高质量的 DNA 纯化产物，可直接用于酶切、测序等后续的分子生物学试验。本试剂盒具有以下特点：1.适用范围广，回收效率高，对于100 bp 10kb之间的DNA片段回收效率在90%以上。2.操作简单快速，整个回收过程仅须5分钟左右。3.洗脱效率高，洗脱体积最小可低至15 l。快速操作流程（快速操作流程（PC

3、R 产物纯化）产物纯化）1.准备工作。a.检查 Wash Solution 中是否已加入乙醇。b.检查 Buffer B3 中是否已加入异丙醇。c.检查 Buffer B3 是否出现沉淀。2.在PCR反应液中加入5倍体积的Buffer B3，充分混匀。3.8,000 g离心30秒。倒掉收集管中液体。4.加入500 l Wash Solution，9,000 g离心30秒，倒掉收集管中液体。5.重复步骤4一次。6.空柱于9,000 g离心1分钟。7.将吸附柱放入一个干净的1.5 ml离心管中，在吸附膜中央加入15-40 l Elution Buffer，室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中DN

4、A溶液。收集 上柱 洗涤 洗脱 收集 上柱 洗涤 洗脱 试剂准备试剂准备 1.自备材料：水浴锅、小型高速离心机（最大离心力 12,000 g）、1.5 ml离心管、无水乙醇、异丙醇等。2.按瓶身标签说明在Wash Solution中加入相应量的无水乙醇（乙醇终浓度为80%），混匀后在瓶身做好标记。密封于室温保存。3.按瓶身标签说明在Buffer B3中加入相应量的异丙醇（异丙醇终浓度为20%），混匀后在瓶身做好标记。密封于室温保存。4.Buffer B3在低温下可能产生沉淀，使用前请检查，如有沉淀，请于37C溶解沉淀，待冷却至室温后使用。标准纯化步骤标准纯化步骤 1.将PCR反应液或酶促反应液

5、移至一干净的1.5 ml离心管中，加入3倍体积的Buffer B3，充分混匀。首次使用前请先检查是否已加入适量的异丙醇。若反应液体积过小，可用 TE 或水补足至 100 l，然后再加入 300 l Buffer B3。2.将混合液全部移入吸附柱，8,000 g离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。如果体系总体积大于 750 l，则每次使用 750 l，多次上柱。将滤出液再次加入吸附柱中再次过柱，可以进一步提高 DNA 回收率。3.向吸附柱中加入500 l Wash Solution，9,000 g离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。Wa

6、sh Solution 首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。4.重复步骤3一次。5.将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000 g离心1 min。此步绝不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。6.在吸附膜中央加入1540 l Elution Buffer，室温静置12 min，9,000 g离心1 min。将所得到的DNA溶液置于-20C保存或用于后续试验。Elution Buffer 为 2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，可以用 TE 或水（pH 7.0）代替。将 Elution Buffer 预热至 60C 可以进一步提高得率。如果片段 4 kb，在 3760C

7、 温浴 2 分钟可以显著提高得率。请勿使用小于 15 l 的洗脱液进行洗脱。常见问题解答常见问题解答 1.PCR产物回收效率较低或者未回收到目的片段 a.Wash Solution 中未加入正确量的无水乙醇。b.提高 Buffer B3 的相对浓度，增加 DNA 与吸附膜的作用时间（静置时间），在一定程度上可以提高回收率。c.如果纯化的片段长度大于 4 kb 或者目的片段含量较少，可将洗脱液再次加入吸附柱进行洗脱，以提高回收效率。d.洗脱液加入位置不正确。洗脱液应加在硅胶膜的中心部位，以完全覆盖硅胶膜的表面，达到最大的洗脱效率。e.洗脱液不合适。洗脱缓冲液的 pH 值对洗脱效率有影响，如果使用

8、水进行洗脱，请确保其 pH 值 7.0，pH 值过低可能导致低洗脱效率。f.洗脱时将洗脱液预热至 60C 后使用，有利于提高洗脱效率。g.洗脱时间过短。洗脱时间对回收率也有影响。洗脱时放置 1 分钟可达到较好的效果。2.回收的PCR产物进行后续酶切或者连接效率低 a.若洗脱产物中含有残留的乙醇会影响酶切。可将空柱离心后的吸附柱开盖室温晾干 25 分钟，有助于残留的酒精挥发完全。b.盐份的残留。请确保使用 Wash Solution 冲洗两次，每次 500 l 沿管壁加入，有助于彻底去除管壁上的盐份。c.回收后的 PCR 产物在反复冻溶的情况下，会加速末端 A 和整个 PCR 产物的断裂，从而造成与 T 载体连接或直接酶切效率的下降。建议回收后立即进行酶切或连接实验。d.选择合适的 PCR 产物和 T 载体的分子数比例，有助于提高连接效率.e.请确保 PCR 最后 72C 510 分钟的延伸时间，这样才有足够的 PCR 产物在末段带有 A 附加碱基，保证较高的连接效率。3.回收的片段为什么电泳上样会漂起来？主要原因是纯化过程中的乙醇没有去除干净。可将离心后的吸附柱开盖室温干燥 25 分钟，有助于残留的酒精挥发完全。