GSTpulldown技术在蛋白质相互作用中的应用.pdf

1、中国生物制品学杂志 2014 年 10 月第 27 卷第 10 期 Chin J Biologicals October 2014，Vol.27 No.10随着人类基因组计划的完成，生物学的研究步入后基因组时代，对基因功能研究的重心也随之转移到基因翻译后的蛋白质上。蛋白质功能已经成为当下研究的热点之一。蛋白间相互作用在细胞的生命活动中起着关键作用。相互作用的蛋白之间通过形成复杂的功能性复合体，参与细胞内一系列的信号级联反应，从而调控细胞及个体的生命活动1。研究蛋白质相互作用有多种方法，其中 pull down 技术是重要的一种。pull down 技术作为检测蛋白质间相互作用的有效手段，已广泛

2、应用于分子生物学领域。常用的 pull down 方法主要有两种：一种是用带组氨酸（histidine，His）标签（His-tag）的亲和纯化柱进行的；另一种是用谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione S-transferase，GST）标签（GST-tag）的亲和纯化柱进行的。GST-pull down 技术自从 1988 年 Smith 及其研究团队纯化出带有 GST 标签的融合蛋白后，逐渐成为体外研究蛋白间相互作用的主要手段2，人们利用这种技术，在体外证明蛋白间存在直接作用关系3-4。尽管 GST-pull down 技术在体外验证蛋白间是否存在直接作用关系时有较强的特异性，但在下

3、结论时仍需慎重。本文在前人研究基础上，就 GST-pull down 技术的原理及其应用及该技术在应用中需要注意的部分问题进行综述。1 GST-pull down 技术原理GST-pulldown技术是在GST融合蛋白的基础上发展起来的2，GST 能与谷胱甘肽特异性结合，其作为表达标签蛋白，能促进原核表达蛋白的正确折叠及可溶性表达5。GST-pull down 主要包括以下 3 部分：利用基因重组技术构建带有 GST 标签的原核表达载体；通过原核表达系统表达带有 GST 标签的融合蛋白；利用 GST 亲和纯化柱进行蛋白纯化，G S T-p u l l d o w n 技术在蛋白质相互作用中的应

4、用柴政斌1，2，张更林1，韩金祥11.卫生部生物技术药物重点实验室 山东省罕少见病重点实验室 山东省医药生物技术研究中心山东省医学科学院，山东 济南 250062；2.济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东 济南 250062摘要：蛋白间相互作用在细胞的生命活动中起着关键作用，GST-pull down 技术被广泛用于体外验证蛋白间的直接相互作用。GST-pull down 技术既可用来验证已知蛋白间的相互作用，也可用来寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白。虽然该技术在体外验证蛋白间的相互作用上有着较强的特异性，但下结论时仍需慎重。本文就 GST-pull down 技术的原理及其应用

5、及该技术在应用中需要注意的部分问题进行综述。关键词：GST-pull down；蛋白质相互作用；融合蛋白中图分类号：Q5-3Q816文献标识码：A 文章编号：1004-5503（2014）10-1354-05Application of GST-pull down technique in study on protein-proteininteractionCHAI Zheng-bin，ZHANG Geng-lin，HAN Jin-xiangKey Laboratory for Biotech-Drugs of the Ministry of Health，Key Laboratory fo

6、r Rare and Uncommon Disease ofShandong，Shandong Academy of Medical Sciences，Shandong Medical Biotechnology Center，Jinan 250062，Shandong Province，ChinaCorresponding author:HAN Jin-xiang，E-mail:Abstract：Protein-protein interaction play an pivotal role in the vital movement of cells.Glutathione-S-trans

7、ferase（GST）-pull down assay is widely used for the verification of direct protein-protein interaction in vitro，including those betweenthe known proteins and those between known and unknown proteins.Although GST-pull down assay has a strongspecificity in verification of direct protein-protein interac

8、tion in vitro，the conclusion should be given with caution.Thispaper reviews the principle and application as well as some problems during application of GST-pull down assay.Key words：GST-pull down；Protein-protein interaction；Fusion protein通讯作者：韩金祥，E-mail： 综述 1354DOI:10.13200/ki.cjb.000628中国生物制品学杂志 2

9、014 年 10 月第 27 卷第 10 期 Chin J Biologicals October 2014，Vol.27 No.10获得高纯度的融合蛋白；再利用 GST 亲和纯化柱进行蛋白间的相互作用检测。具体原理见图 1。注：获得带有 GST 标签的融合蛋白；将带有 GST 标签的融合蛋白亲和到谷胱甘肽层析柱上；获取可能与融合蛋白发生相互作用的蛋白；与融合蛋白发生相互作用的蛋白被亲和到谷胱甘肽层析柱上；切掉标签，洗脱得到相互作用的蛋白。图 1 GST-pull down 的原理Fig 1.Principle of GST-pull down2 GST-pull down 技术的应用GST-

10、pull down 技术主要在体外验证两种蛋白之间是否存在直接的相互作用，其用途主要有两个方面：一是证实两种已知蛋白之间可能存在的相互作用6-9；二是用于寻找能与已知的蛋白发生相互作用的未知蛋白10-12。2.1 证实两种已知蛋白之间可能存在的相互作用由于两种蛋白均为已知的，因此融合蛋白可以通过原核或真核表达系统获得，另外一种与融合蛋白发生直接作用的蛋白或多肽既可以通过原核表达系统获得，也可以利用体外翻译系统由相应的基因片段直接转录翻译而来。Zhang 等8在利用 GST-pull down研究一种核受体蛋白 SHP 与 Bcl2 蛋白之间的相互作用时，利用体外翻译系统合成了 Bcl2 蛋白。

11、Banko等9在利用 GST-pull down 验证一种功能未知的核内蛋白 ERH（enhancer of rudimentary homolog）的 3 种形式的蛋白 ERH H3A Q9A、ERH E37A T51A、ERHH3A Q9A E37A T51A 与 PDIP46 SKAR 蛋白和Ciz1蛋白之间的相互作用时，ERH 3 种形式的蛋白是通过原核表达获得的。体外翻译系统合成的多肽或蛋白则一般是缺失型蛋白或特定位点突变的蛋白13，在合成的时候可以在要合成的蛋白或多肽N-末端或C-末端加上便于检测的标签14，后续检测不仅可以利用多肽的抗体，而且可以利用所加标签的抗体进行检测，如果认

12、为蛋白间相互作用的结合比较弱，在融合蛋白表达时可以用同位素进行标记，同位素标记可大大提高检测的灵敏度。Borth 等15在利用 GST-pull down 技术验证 IncA 与 G3BP1 这两种蛋白之间是否存在相互作用时，用 S35 标记了蛋白 G3BP1，结果证实，这两种蛋白存在相互作用。2.2 用于寻找能与已知蛋白发生相互作用的未知蛋白由于影响因素有很多，运用 GST-pull down 技术来寻找未知蛋白是比较复杂的，最主要的就是所要检测的未知蛋白的来源。已知蛋白可通过融合蛋白的形式表达纯化出来，而未知蛋白只能通过提取特定细胞或组织的蛋白来实现，选取的细胞或组织不仅要含有能与已知的蛋

13、白发生作用的蛋白，而且表达水平要高16，这种情况下也可选择放射性标记蛋白，以确保检测的灵敏性。Shen 等11利用这一应用筛选出的dermcidin（DCD，一种存在于汗液内的活性多肽）是Nck1 新的结合蛋白。Zhang 等12同样利用这一应用筛选鉴定出能与 HBx 蛋白发生相互作用的 apoA-I蛋白。3 GST-pull down 技术应用时要注意的问题GST-pull down 技术在体外验证蛋白间直接的相互作用时有较强的特异性，但存在一定的局限性，GST-pull down 技术不能用于大规模的蛋白间相互作用的筛查；内源性蛋白的干扰使实验结果出现假阳性。因此要求在实验中充分考虑可能对

14、实验结果造成影响的因素，以减少假阳性的出现1，17-18。通过已有研究报道及本实验室的研究经验，在进行 GST-pulldown 实验时应该考虑以下几点。3.1 高纯度 GST 融合蛋白的获得由于高纯度的融合蛋白能减少实验结果的假阳性，因此获得高纯度的融合蛋白对于 GST-pull down 实验的结果分析具有重要的作用。同时，为了能最大程度地保证融合蛋白原有的生物学活性，一般在获取融合蛋白时倾向于可溶性融合蛋白，因此获得高纯度可溶性融合蛋白很关键。下面对可溶性蛋白的获得条件进行简单的分析讨论。3.1.1 载体的选择载体的选择对融合蛋白有很大的影响，根据不同的实验需要构建的载体也是不同的。首先

15、是所表达的融合蛋白的可溶性。pGEX 载体所带的 GST 标签能够增强下游蛋白的可溶性表达，使融合蛋白易于表达纯化。此外 pGEX 载体由于具有 Ptac 位点，能被 IPTG 诱导表达，还有控制过表达的 lacIq位点，能够保证目的蛋白的高质量表达，因1355中国生物制品学杂志 2014 年 10 月第 27 卷第 10 期 Chin J Biologicals October 2014，Vol.27 No.10此成为目前构建 GST 融合蛋白最常用的原核表达载体19。随着分子生物学的不断进步，该载体经过不断改造，已经有不同的亚型，用以满足不同的实验需要。3.1.2 可溶性融合蛋白表达条件的

16、选择蛋白表达是个非常复杂的过程，受诸多因素的影响，除了前面讨论的载体的选择外，通过总结和对比前人的研究成果，结合本实验室的探索和研究，发现影响蛋白可溶性表达的主要因素还包括诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间。不同的融合蛋白需要的可溶性表达条件不同20，因此，前期实验中，探索融合蛋白可溶性表达的最佳条件是很有必要的。3.1.2.1 诱导温度诱导温度选择对蛋白的表达是很重要的，不同温度下融合蛋白存在的形式不一。高温诱导适用于温度敏感型表达载体，温度敏感型的突变体要在 42 时才会发生转录作用21-22。多数情况下是在低温下获得可溶性蛋白。低温有利于增强蛋白的稳定性和正确折叠，容易获得可溶性的蛋白，而较高温度则易形成包涵体。对于常用的载体而言，由于蛋白间存在较强的温度依赖性疏水作用，温度高时蛋白易聚集形成沉淀，这会增加了蛋白形成包涵体的可能。有文献报道，降低温度能减慢蛋白合成的速率，改变多肽折叠的动力学，从而增加蛋白的正确折叠23。但是温度并非越低越好，温度太低会使细菌的生长速度变慢，甚至停止生长，从而影响融合蛋白的表达。从目前研究报道来看，获取可溶性蛋白的最佳诱导温度一般集中在 20 30。V