胶原蛋白降解物高效液相色谱／质谱联用分析.pdf

1、中国生物工程杂志 C h i n a B i o t e c h n o l o g y，2 0 0 5，2 5(2)：6 6 7 2 胶原蛋白降解物高效液相色谱 质谱联用分析*孙爱梅 张 贵锋 倪 文 苏志国 (1北京科技大学 土木与环境工程学 院 北京 1 0 0 0 8 3 2中国科 学院过程工 程所生化工程 国家重点实 验室 北京 1 0 0 0 8 0)摘要 利用高效液相 色谱 质谱联 用技 术分析 了胶 原蛋 白 I I 和 I经变性和酶解 处理得 到的 多肽 混合物，比较研 究 了两种类型胶原蛋 白降解物之间的区别，利用液相 色谱质谱 连用技 术识 别 出了 不 同类型胶原蛋 白

2、中的特征肽段。胶原蛋 白在 5 0 处理 3 h可溶解于盐溶液，凝胶过滤分析 结果 表明，热变性 的胶原蛋 白分子量在 1 0万以上，因此在 热变性过程 中胶原蛋 白的三螺旋 结构被破 坏但没有明显的随机 降解。利 用胰蛋 白酶对胶原蛋 白进行 了酶切 处理，在酶 用量 为 2，p H 8 1 8 2，温度 3 7 条件 下，处理 2 0 h后 胶原蛋 白降解较 完全，多肽 混合 物 的平均分子量 在 1万以 下。利用液质联 用技术研 究 I I 型和 I型胶原蛋 白降解物 中的 多肽，通过 多级质谱分析 了胶原蛋 白降解物 多肽的序列。结果表明，不 同类型的胶原蛋 白酶解后 的多肽 混合物

3、中存在特定序列 的 特征肽段，利用特征肽段进行胶原蛋 白类型识别是可行的。关键词胶原蛋 白 酶解 高效液相 色谱质谱 胶原蛋 白是一种 由动物 细胞 合成的生物 高分 子，作为细胞外基质 中重要 的成份几乎存在于所有 组织 内，约 占哺乳动物总蛋白的 1 3。近年来，研 究 发现许多疾病与胶原蛋 白密切相关，如胶原蛋 白的 含量、分布、代谢 及其动态变化异常会 引起骨质 疏 松、动脉瘤 和椎 间盘 突出等疾病。因此，建立 快 速的胶原蛋 白分析方法不仅有 利于疾病的早期 诊 断，也有助于认识致病 机理等。另外，胶原蛋 白由 于 良好的生物学特性和弱抗原性 在化工、保健 品、医学及材料等领域得到

4、广泛应用，不同类型的胶原 蛋 白应用领域各异，建立快速 的胶原蛋 白分析方 法还有利于胶原类产品的质量控制。胶原蛋 白分子长约 3 0 0 n m、直径约 1 5 n m，由 3 条肽链 以平行、右旋 的形 式缠绕而成，组成胶原 蛋 白的 a 肽链 自身 为左 手螺旋结 构。每条肽链 的序 列特征表现，为每隔两个其它氨基酸残基即有一个 甘氨酸，其序列可用 G l y X Y表示(X常 为脯氨酸，Y常为羟脯氨酸或羟赖氨酸)I 3 。根据 构成 其肽链 的差异，胶原蛋 白可分 为多种类 型，目前 人们在 脊 椎动物中 已鉴别 出至 少 2 7种大 小、序 列、组 织 分 收稿 13期：2 0 0

5、4 0 9 1 0 修 回 13期：2 0 0 4 1 2 0 7 *国家 自然科学 基金资助项 目(2 0 1 3 6 0 2 0)*通讯 作者，电子信息：z g s u h o m e i p e a c c n 布、分子组成各异的胶原蛋 白 。许 多胶原蛋 白在 常温下难溶于水，因此直接分析存在一定 困难。文 献中通常使用 特异性 的酶或 溴化氰部分降解 胶原 蛋 白使其溶解 于水溶液。对于胶 原蛋 白降解 产 物的分析，1 9 9 9 年 M i k g f k 等 利用凝胶过滤色谱在 S e p d e x G 一 1 5柱上实现 了 I 型胶原 a 1 链、链、V型 胶原和 I 型

6、胶原 C N B r 肽的分离。凝胶过滤色谱是 级分蛋白质和测定蛋 白质分子量分 布的 良好方法，其缺点是色谱柱峰容量有 限，分离 度较低，不宜用 于分子 大小 及组成 相似 或相差 很小 组分 的分 离。其他分析方法 包括离 子交换 色谱、反相 色谱、亲和色谱、电泳或毛细 管电泳 等。由于不 同类 型胶原蛋 白降解物性质相 似、分子 量差别不 大，因 此这些方法存在分辨能力较低、准确性差和重现性 不理想等 问题，不能对混合物中的不同胶原 蛋 白同 时进行检测。针对 目前胶原蛋 白分析方法中存在的不足，本 研究旨在探索利用质谱检测特征肽段进行胶原蛋 白类 型识别的可行性。实验通 过热变性 的方

7、法将 胶原蛋白进行溶解，利用胰蛋 白酶对热变性 的胶原 蛋 白进行 了酶切处理。利用 液相色谱 质谱联用技 术分析胶原蛋 白的降解物，比较研究了不同类 型胶 原蛋白降解物 中多肽的区别，结果表 明，不 同类 型 胶原蛋 白酶解物 中存在特征肽段，利用特征肽段进 维普资讯 http:/ 孙爱梅 等：胶原蛋白降解物高效液相色谱 质谱联用分析 6 7 行胶原蛋白类型识别具有可行性。l 材 料与方 法 1 1 试剂和仪器 胶原 蛋 白 I I、I均 为 S i g m a公 司产 品(进 V 1 分 装)，胰蛋 白酶为 A m r e s c o 公 司产品，色谱纯 乙腈 和 三氟 乙酸分别购 自 F

8、 i s h e r 公 司和 Me r c k公 司，考 马 斯亮蓝 G 2 5 0为 F l u k a 公 司产品。其 它试剂均 为市 售分析纯，实验用水为 Mi l i Q自制纯水。实验用仪器分别为高效液相色谱 A g il e n t 1 1 0 0，二极 管 阵 列 检 测 器 U V 6 0 0 0，蒸 发 光 散 射 检 测 器(E L S D)S E D E X 7 5，离 子阱质谱(电喷雾离子 源，型 号 L C Q D e c a X P，美 国热 电公 司)，数据 采集 与分 析 软 件 X c a l i b u r，紫 外 分 光 光 度 计 U h r o s p

9、 e c 2 0 0 0 (P h a r m a c i a B i o t e c h)。1 2 变性温度测定 称取多份相 同质量胶原蛋 白悬浮 于相 同体积 T r i s H C 1(p H 8 1，5 0 m m o l L含，1 m o l L N a C 1)缓 冲液 中，在 4 0 C到 1 0 0 C 不 同的温度下加热，每份胶原 蛋 白在特定的温度下加热 3 h。在每个特定 的温度 下，每隔 2 0 m i n取样，离 心后测 定上 清液 中溶解 的 胶原浓度(考马斯亮蓝染 色法)。测定胶 原在不 同 温度下的初始溶解速率和最大溶解度。1 3 胶原蛋白酶解 将热变性的胶原蛋

10、 白溶液(p H 8 1)温度控制在 3 7，加入胰蛋白酶，研究酶用量与降解速率的关 系。1 4 高效液相色谱分析 反相色谱：色谱柱：V y d a c C 4，流动相：A：水(含 0 3 T F A)，B：乙腈(含 0 3 T F A)，流 速：0 6 m l m i n；梯度：02 0 m i n，5 1 5 B，2 06 0 m i n，1 5 2 5 B，保 持 此 比例 1 0 m i n；进样 量：5 0 t d。E L S D 参 数：漂 移 管 温 度 4 0 ，雾 化 气 体(N 2)流 速 2 0 l dmi n。凝胶 过 滤：色谱 柱 T S K 2 0 0 0 S W(

11、7 53 0 0 m m，1 0 t t，T O S O H B I O S E P)，流动相为 5 0 m m o l L磷酸盐缓 冲液(p H 7 0含 1 m o l L N a C 1)，流速 0 5 m l m i n；进样 量 5 t d，检测波长 2 3 0 n m。1 5 液质联用分析 色谱流动相经分流阀分流后进入质谱，分流 比 控制在 9：1(1 0 进入 质谱)。质谱条 件：电喷雾 离 子源壳气流速 4 0 a r b，喷雾 电压 5 k V，自加热金属 毛 细管温度 2 7 5 o C。扫描模式为全 扫描检测，扫描 范 围 m z 2 0 02 0 0 0，精确质量数扫描

12、(z o o m s c a n)和二 级质谱(MS MS)的 扫描 模 式 为 数 据 依 赖 型 扫 描(d a t a d e p e n d e n t s c a n)。2 结 果 2 1 胶原蛋 白热变性 胶原蛋 白难直接溶于水，但经热变性处理后其 三螺旋结构发生变化，这种热变性的胶原蛋 白可以 溶于高浓度盐溶液。如图 1 所示，4 0(1 T1 0 为 3 1 9)时几乎 不 溶解，4 0 至 5 0(1 T1 0 为 3 1)之间，胶原蛋 白溶解量 随温度升高而增大，2至 3 h溶解 量 达 到最大，之后 溶解 量基 本保 持 稳定。凝胶过滤色谱分析结果表明，溶解的胶原蛋 白分

13、子 量较高(图 2)，经与 分子量标 准品对 照，溶解 的胶 原蛋 白分子量在 1 0万 以上。据 文献报道，温度 低 于 5 0 时，胶 原 蛋 白只 发 生 了 三 螺 旋 结 构 的 解 离，但单 链没 有 明显 的随机 降解。当温度 高 图 1 温度对胶 原蛋 白 I 溶解 度的影 响 F i g 1 Ef f e c t o f Te mp e r a t u r e o n h e a t sol u b i l i s a t i o n o f c o l l a g e n t min 图 2 胶原 蛋 白 I 热变性 溶液凝胶 过滤 色谱 图 F i g 2 G e l f

14、i l t r a t i o n c h r o ma t o g r a m o f Co l l a g e n I s olut i o n 一】I邑一 J)暑 0 一 维普资讯 http:/ 6 8 中国生物工程杂志 C h i n a B i o t e c h n o l o g y V o 1 2 5 N o 2 2 0 0 5 于 6 0 时(1 T1 0 为 3 0)，溶解 曲线 出现转折点，凝胶过滤 色谱分 析结果 表明在 温度 高于 6 0 时，溶液 中存在分子量低于 1 0万 的组分。这表 明在较 高温度 下，胶 原蛋 白不 仅会发 生三 螺旋 结构 的解 离，而且单

15、链会发生明显 的随机降解。因此 为控制 胶原蛋 白只进行三螺旋 结构解离 而不 发生随机 降 解，变性温度 应控制 在 5 0。胶 原蛋 白溶解 经热 变性处理后在1 2 0 0 0 g 下 离心 1 0 m i n，上清液 中的变 性胶原蛋 白直接进行酶法降解。2 2 胶原蛋 白酶解 胰蛋 白酶对天然胶原蛋 白几乎没有作用，但 可 以降解变性 的胶原蛋 白。影响胶原蛋 白酶解 的因 素主要 包括 酶 用量、酶 解 时 间、p H、水 解 温 度等。胰蛋白酶水解 胶原 的最适 条件 是 p H 8 1 8 2、温 度 3 7 。在此条件 下，实验考察 了酶用 量和 时 l 0 o 8 O 6

16、0 l 皿 譬 4 o 髓 2 O O O l 2 3 4 5 6 7 t mi n 图 3 酶用量 和时 间与水解 度的 关系 F i g 3 Eff e c t o f q u a n t i t y o f e n z y m e a n d t i m e o n t h e p e r c e n t a g e o f d i g e s t e d c o l l a g e n 2 3 胶原蛋白水解物 H P L C分析 胶原蛋 白经酶解后形成一 系列分子量不 均一 的多肽混合物。为 了比较不 同类 型胶原蛋 白水 解 物之 间的区别，本实验在相同的变性条件和酶解条 件得到 了胶原蛋 白 I I 型、I 型酶解液，并利用 H P L C E L S D对 降解产物进行了比较研究。如图 5所示，I I 型胶原蛋 白和 I 型胶 原蛋 白经 酶解处理 1 2 h后降解较为完全，酶解混合物 中几乎 没有未降解 的胶原蛋 白，水解物经反相色谱分离后 可得到多种组分。从 H P L C E L S D色谱图(图 5 A)可 见，胶原蛋 白 I I 经水 解后其 主要组 分保 留时