林木转基因工作研究进展.pdf

1、第 28卷第 4 期2001 年 12 月湖 南 林 业 科 技Hunan Forestry Science&TechnologyVol.28 No.4Dec.2001?收稿日期:2001-09-03?修订日期:2001-10-28文章编号:1003-5710(2001)04-0019-07林木转基因工作研究进展贺晶,谭晓风,杨伟(中南林学院经济林育种与栽培国家林业局重点实验室,湖南 株洲?412006)摘?要:综合论述了近年来国内国外林木转基因工作研究进展,其中主要就林木转基因的方法、转基因植株鉴别、转基因在林木上的应用几方面进行了探讨,并将国内外林木转基因工作列表加以综合,最后指出了林木转

2、基因工作中尚存在的问题及对未来转基因工作的展望。关键词:林木;转基因;研究进展中图分类号:Q813?文献标识码:AThe progress of gene transformation in treesHE Jin,TAN Xiao-feng,YANG Wei(National Forestry Bureau Key Laboratory of Non-timber ProductForestry Breeding and Cultivation,Central South Forestry University,Zhuzhou 412006,Hunan,China)Abstract:The

3、progress of gene transformation in forest trees was summarized in the paper.T he methods,theidentification and application were major discussed in the paper.The internal and external study achievementswere summed up in two charts.At the end of the paper,the existing problems and outlook of the gene

4、trans?formation in trees were pointed out.Key words:forest tree;gene transformation;progress?生物技术自 70 年代崛起以来,发展非常迅猛,现已成为世界新技术革命的重要组成部分。生物技术将为人类的未来带来极大的社会效益和经济效益,尤其对未来的农林业生产将带来一场新的绿色革命。植物基因工程技术是植物生物技术的核心内容之一,它是将带有一些特有性状的基因克隆,并通过生物、物理、化学等方法,导入受体植物细胞,得到具有外源基因表达的转基因植物。外源基因导入植物受体包括目的基因的分离,外源基因与载体分子的体外连接,

5、基因转化,转基因植株培养,外源基因的鉴别等步骤。林木转基因研究工作与农作物等其他草本植物相比,一直处于相对比较落后的位置,近几年来,随着分子生物学研究技术不断成熟,木本植物在这一方面也取得了长足的进步,本文旨在对林木转基因研究工作现状做一综述。1?林木转基因方法基因转移方法大致可以分为两类:一类是基因的直接转化法;另一类是通过一种可以使植物致瘤的土壤农杆菌的质粒来转化植物1。1?1?直接 DNA 转化法直接 DNA 转化法是将外源基因(DNA)直接转化植物原生质体或植物细胞,由此获得转基因植物。这些方法包括以原生质体为受体的 PEG 转化法、电激法、脂质体介导转化法、显微注射法、激光微束法、超

6、声波法、花粉管通道法以及基因枪技术等。基因枪技术又称粒子轰击技术(Particlebombardment)、生物发射技术(Biolistic process)或高速微粒子发射技术(high-velocity micropro?jectile),它是借高速度运动的金属微粒将附着于其表面的核酸分子引入到受体细胞中的一种遗传物质导入技术 2。基因枪大体可以分为火药式、放电式、和气动式三种类型。它具有无宿主限制,受体类型广泛,操作简便,快速等特点。目前,在林木上基因枪成功应用的例子有杨树、云杉、蔓越桔、番木瓜等。1?2?农杆菌介导植物转化农杆菌(Agrobaterium)介导的遗传转化是外源 DNA

7、导入植物最成功和应用最为广泛的方法。自 1976 年 D?Cleene 和 D.LEY4首次报导用根癌农杆菌 B6(LMG18)也能感染裸子植物受伤组织并产生冠瘿瘤(crown gall)后,许多学者开始利用农杆菌进行木本植物的基因转移。农杆菌转化植物细胞是通过将其体内的一段 T-DNA 转移到被侵染植物细胞而实现的。农杆菌介导的基因转化具有转化频率高,导入细胞片段确切,遗传物质扩散危险低,导入基因拷贝数低,表达效果好的特点。其因转化受体系统及方法主要有下面 5 种。(1)受伤 植物 器 官的 直接 转 染。1985 年,Horsh 6等首创根癌逐杆菌介导的烟草叶盘转化法获得转基因植株,使人们

8、考虑直接用木本植物的组织块进行转化。最常用的木本植物外植体为受伤叶片、茎段和叶柄,已在欧洲黑杨、毛白杨、杨树、黑刺槐、苹果、李、桃、杏、猕猴桃、柑桔7 17等树种上得到成功。冯勤等18以小粒种咖啡幼小胚苗的下胚轴及子叶为转化受体,用野生型根癌农杆菌感染,得到了可继续生长的畸胎小芽并测到了 GUS 基因的表达,进一步扩大了叶盘法的应用范围。(2)整体植株接种共感染。一般采用种子实生苗或试管苗作为外植体,人为地在整体植株上造成创伤,然后把农杆菌接种在创伤面上,或用针头把农杆菌注射到植株体内使其进行侵染转化。目前此方法主要针对针叶树叶形细小,韧皮部粗厚的特点,在部分针叶树种上得到成功。如欧洲落叶松、

9、杂种落叶松和挪威云杉上得到稳定的再生转化株19。(3)受体细胞胚或胚性细胞转化。1988 年McGranna han 等20首次报道了美国西部核桃体细胞胚转化 NPT-?等基因获得成功。近年来用体细胞胚作为外植体已在核桃、山核桃、木瓜、桃上得到转化 21 24。Wenck 等 25最近报道用快速分裂的胚发生悬浮培养细胞与农杆菌共培养,得到高效表达报告基因的挪威云杉和火炬松。(4)原生质体的转化。Gupta 等26将荧光素酶基因转入北美黄杉及火炬松原生质体中,并在培养过程中存活的原生质体及再生细胞中测到了外源基因的表达,但木本植物原生质体培养周期长,难度大,再生频率很低,多数培养仅能形成细胞团和

10、愈伤组织,真正得到转化的报道很少。(5)附体腋芽转化。李卫等 27利用沙田柚一年抽梢三四次及自然出芽的特点,采用农杆菌直接感染附体叶腋并辅以打顶、生芽培养基促芽生长的方法,选择从芽诱导生根得到表达 GUS 基因的完整转基因植株,转化有效率为常规农杆菌介导法的3 6倍。2?转基因植物的鉴别获得转基因植株后,鉴定外源基因是否转入的方法一般包括:报告基因检测、DNA 分子鉴定、RNA 分子鉴定、蛋白质分子鉴定等。检测报告基因(Gus,Nos,Gat 等)是较为方便的鉴定手段,可以确定外源基因的存在和表达,主要用以筛选转化植株;DNA 分子鉴定包括点杂交、Southern 杂交和 PCR 扩增等。So

11、uthern 杂交应用较为普遍,其特点是可信度高,可以获得外源基因整合位点、整合特性和拷贝数等大量信息,但操作程序复杂,鉴定的样品数量有限。而 PCR 扩增由于其快速、简捷,只需少量 DNA 样品,且能鉴定大量样品的优点,目前应用最为普遍。RNA 分子鉴定一般采用点杂交和 Northern 杂交,用以了解外源基因的转录情况。DNA 和 RNA 分子鉴定依赖于碱基因互补配对的原理,而蛋白质分子鉴定的基础是抗原抗体反应,主要有 Western 杂交和酶联免疫技术,但在林木转基因植株鉴定中较少用到 28 31。3?林木转基因的应用3?1?林木的抗虫性研究林木虫害严重,抗虫基因工程为解决这一难题提供了

12、一个有效手段。(1)Bt 毒蛋白基因。Bt 毒素对许多害虫都有抑制和杀伤作用,作为生物杀虫剂被广泛应用于林木的害虫防治。Bt 毒素对某些森林害虫尤其对鳞20?湖南林业科技?第 28 卷翅目的害虫抗虫效果显著。伍宁丰等321991 年首次报道了用 Bt 基因转化欧洲黑杨,得到转基因植株。田颖川等 61993 年用 含 Bt 基因的农杆菌LBA4404 转化欧洲黑杨,共获得 54 株转基因植株。此外,一些研究者还获得转 Bt 基因美洲黑杨、胡桃等。(2)蛋白酶抑制剂基因。蛋白酶抑制剂也是一类抗虫小分子蛋白,可以使害虫消化不良,延长其发育时间,减少每年的繁殖代数,降低害虫的种群数量。蛋白酶抑制剂一般

13、不会引起害虫的彻底死亡,这就避免产生较高的选择压力,害虫的抗性不至很快提高。目前已获得苹果、杨树、桦树 33等树种的转基因植株。(3)蝎神经毒素基因。资料表明,昆虫特异性蝎神经毒素 AalT 具有较高的选择性,对哺乳动物和其他动物无害,安全性好,对许多鳞翅目害虫具有较高的毒性,是十分理想的抗虫基因源 34。伍宁丰等32通过农杆菌介导法,利用优化了的密码子的 AalT 基因转化杨树杂种 NL-80106 获得转基因植株。3?2?林木的抗病性研究林木病毒病害是造成损失最大的病害之一。通常有 5 种方法,它们是分别借助于病毒的外壳蛋白基因、病毒的卫星 RNA、病毒的反义 RNA、植物本身编码的抗病基

14、因、病毒的其他基因。最常用的是用病毒外壳蛋白基因培养抗病毒植株。目前这一技术已用于柑桔上。3?3?林木的抗除草剂研究林木抗除草剂基因工程中,目前导入木本植物的外源基因主要有:来自沙门氏菌的 aroA 基因和来自吸水链霉菌的 bar 基因,Fillatli J 等 37用农杆菌介导突变的 EPSP 合成酶基因 aroA,转入银白杨 大齿杨中,转基因植株获得了对除草剂草甘磷的抗性。De Block M 等 38在 1990 年,用 bar 基因转化银白杨 美洲黑杨,转基因植株与对照相比,明显抗草甘磷。3?4?改善材质木质素是维管植物细胞壁的组成成分,在木本植物中,木质素的含量在 15%36%干重,

15、在制浆造纸工业中必须除去,这需要消耗大量能源,并产生大量的有害物质,降低林木中木质素的含量和改良木质素的组成,对于改善环境,提高经济效益都有积极的意义。木质素的形成由一系列酶促反应完成,肉桂醇脱氢酶(CAD)是催化木质素前体生成的最后一步反应。Baucher 等 341996 年利用反义 DNA 和共抑制策略,使转基因杨树植株的 CAD活性 减 少 70%。另 一 种 咖 啡 酸 羟 基 转 移 酶(COMT)催化木质素单体形成。Doorsselaere JV在 1995年构建了反义和有义的 COMT 基因,并导入欧洲山杨和银白杨中,反义构建的四个转基因植株中,有 2 株 COMT 活性减少

16、70%,另外两株减少 95%。3?5?生产药物目前,许多对人体有用的天然药物在自然界中含量稀少,提取困难,成本昂贵,转基因工程是解决这一矛盾的有效措施之一。如紫杉醇是从红豆杉属植物中分离出的一种紫杉二萜化合物,是近年来国际公认的最好的抗肿瘤药物之一37。但是这种药物难以获得。黄遵锡等用发根农杆菌 A4 感染短叶红豆杉芽外植体,诱导产生毛状根经检测含有紫杉醇。3?6?品质的改良大量研究表明,利用花粉管道可使外源 DNA进入受体并参与基因组的整合在其后代得以表达,用 RAPD分子验证,结果表明,在后代基因组中找到了供体具有而受体没有的特异 DNA 片段,从而达到改良林木品种的目的,但是在林木育种上的应用尚不多 见。易鹏等38通过直 接导入外 源DNA,将带有目的性状的供体 DNA 通过花粉管进入木豆胚囊,实现了远缘基因的转移,使大豆贮藏蛋白在木豆遗传背景中得以表达和遗传,使木豆蛋白含量低的性能得以改善。3?7?基因调控的研究通过研究转基因林木中外源基因的插入与表达,进一步阐明基因表达机制。Han K H 等 1997年利用杨树遗传转化系统,研究影响外源基因表达的因素,发现当外源基因两端的构