脉冲场凝胶电泳.docx

1、脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳.脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在102000kb 之间的DNA 片段。这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越

2、长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在102000kb 的DNA 片段分开。FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LN

3、aCl；0.1mol/LEDTA。2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%Brij58；0.2% 脱氧胆酸盐(Deoxycholate；0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl。（生物秀实验频道 ）4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。6RNase(10mg/mL。7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品 。8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中 。90.5g/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化

4、大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。210mg/mL tRNA。35mol/L NaCl。4 苯酚/氯仿。53mol/L NaAc，pH5.2。695%乙醇。3. 设备1TBE 缓冲液。2Seakem HGT 琼脂糖。5 去掉裂解缓冲液，换为10mL ESP 缓冲液于50轻度振摇温育48h 。6 将凝胶块放在10mL 含有174g/mL 苯甲基磺酰氟(PMSF的TE 缓冲液中，室温温育4h(2h 换液一次 ，以灭活ESP 中的蛋白酶K 。7 用TE 清洗琼脂块6h(2h 换液一次 ，置于TE 中4保存。2. 限制酶消化提高PFGE 的分辨率取决于1001000kb 片段电泳结果的重复率，它与

5、酶切关系密切，可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。（生物秀实验频道 ）125L10 反应缓冲液，30U 限制酶，加双蒸水至250L 混匀。2 取一个凝胶块置其中，合适温度下温育过夜(按内切酶要求 后，用TE 缓冲液洗涤并贮存。3. 应用PFGE 对样品DNA 进行分析1 用0.5TBE 缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT 琼脂糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。若用Wide Minisub Cell进行电泳的话，50mL 该溶液即可。2 胶凝后，小心移去样品梳。将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小，将样心地插入加样孔，避免产生气泡。(若样品在溶液中，以l:1的比率与 502%Sea

6、plaque 琼脂糖相混合，迅速注入加样孔中 。3 把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先14冷却。4 将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。打开电源，调节蠕动泵到适当流速(510mL/rain或打开变速泵至40。5 通过计算机启动极性转换程序。大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的电脉冲下得以分离，时间一般为3.5h 或更长。小于50kb的限制性片段在0.4s 正向和0.2s 反向的电脉冲(比率为2:1下得以分离，时间为35h 。6 在 0.5g/mL 溴化乙锭中进行染色并拍照。4. 分离、纯化大的DNA 片段1 凝胶染色、分析后，在目

7、的带前(靠近正极处 切一个 0.25cm2左右的槽，注入0.8%Seaplaque琼脂糖，使之凝固。2 重新打开极性转换开关，用紫外递质检测DNA 的迁移，当目的带进入Seaplaque 凝胶中时，关闭开关，切下目的带，移至1.5mL EP 管中。3 加入2L 的tRNA ，30L 5mol/L NaCl，370L 蒸馏水，在6570之间，化胶并保温10min 。4 苯酚/氯仿500L 抽提两次。5 用2.5 倍体积95%乙醇和1/10 体积NaAc(3mol/L，pH5.2 于-7010min 沉淀水相。再用70%乙醇洗两次并将沉淀溶于TE缓冲液中。【注意事项】1. 换缓冲掖时尽可能小心不要

8、碰坏琼脂凝胶。2.PMSF 是一个强烈的蛋白酶共价抑制剂，即有毒又挥发，操作时应在通风橱中进行。3. 用蛋白酶K 包埋的材料时50温育时间很长(2448h ，有些学者提出如此长时间不必要(Mortimer etal.1990 ，且可能造成高分子质量DNA 降解。在实验中可视情况而定。4. 琼脂糖凝胶块在TE(pH7.6中4可存放数年，如在0.5mol/L EDTA 中可存放更长时间。5. 一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳，因为这些电源设计时均带有保护电路，它可以检测到负载的突然降低并且引发外加电源自动关闭。6. 由于电压较高，就会产生热量，为了保证温度为14，需要一些冷却设备(缓冲液冷却循

9、环器或MiniChiller 。此外，把电泳系统放在一个敞口的冰盒中也可保持恒温。PFGE （脉冲场凝胶电泳）标准操作规程(SOP目的：运用PFGE 方法对20Kb 至数Mb 的DNA 进行分子分型背景知识：这个试验是公认的操作繁琐，至少要2天，而且每一步操作对结果的好坏都有很大影响，因此，一个严格、标准的操作方法是十分十分必要的。主体内容：一、胶块的制备1、在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml 细胞悬浊液(CSB；2、在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称；3、在模具上标记好对应样品的名称；4、用CSB 湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均

10、匀悬浊于CSB 中，用bioMerieux Vitek colorimeter 测其OD 值，并调整至3.64.5。如果OD 值大于4.5，加入CSB 稀释；如果OD 值小于3.6，增加菌量提高其浓度。5、取400l细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。6、从水浴箱中取出eppendorf 管，每管加入20l蛋白酶K(储存液浓度为20mg/ml混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。7、制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56水浴箱中。8、在eppendorf 管中加入400l的1% S

11、eakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。注意事项：(1用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。(2细胞悬浊液、蛋白酶K 要置于冰上。(3在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。(4混合物加入模具时不能产生气泡。(5在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56水浴箱中。二、细胞的裂解1、在50ml 的screw-cap tube上做好标记。2、配制细胞裂解液(CLB：每5ml 细胞裂解液加入25l蛋白酶 K(20mg/ml，使

12、其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。注意：蛋白酶K 要置于冰上，配制好的细胞CLB 也要置于冰上。3、每个管子加入5ml 蛋白酶K/CLB混合液。4、如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。(1可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap 管中。(2一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap 管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。5、保证胶块在液面下而不在管壁上。6、将管子放在54水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。7、将纯水和TE 放在50水浴摇床中预热。三、洗胶块1、从水浴摇床中拿出screw-c

13、ap 管，盖上绿色的screened-cap 。轻轻倒掉CLB 。在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。注意：把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。随后的操作中也如此。2、每管中加入15ml 预热的纯水。3、确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50水浴摇床中，摇10分钟。4、倒掉水，用纯水再洗一次。、5、倒掉水，加入15ml 预热的TE ，在50的水浴摇床中摇15分钟。6、倒掉TE ，用TE 重复洗三次，每次1015分钟。7、倒掉TE ，加入10ml TE，放在4冰箱保存备用。注意：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。四、胶块内DNA 的酶切1、在1.5ml eppendorf管上标

14、记好相应的样品及H9812的名称。2、按照下面的比例配制缓冲液H 的稀释液，混匀。试剂l/胶块l /10胶块纯水180l1800lBuffer D20l200l总体积200l2000l注意：缓冲液要置于冰上。3、在每个1.5ml eppendorf管中加入200l缓冲液H 的稀释液。4、小心从TE 中取出胶块放在干净的培养皿上。5、用刀片切下2mm 宽的胶块放入1.5ml eppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE 中。6、用同样的方法处理标准株H9812的胶块。7、将管子放在37水浴中孵育10-15分钟。8、在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液

15、，混匀。试剂l/胶块l /10胶块纯水175l1750lBuffer D20l200l酶(10U/l5l50l总体积200l2000l注意：(1将酶置于冰上，用后立即放在20保存。(2用枪头吸出缓冲液H ，避免损伤胶块。9、每管加入200l混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。10、在37水浴中孵育至少2小时。五、加样(一 将胶块直接粘在梳子齿上1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使其水平。2、从37水浴中取出胶块，平衡到室温。3、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。4、每管加入200l 0.5TBE 。5、把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上。6、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。7、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的