间充质干细胞临床实验中的问题及其解决策略.docx

1、间充质干细胞临床实验中的问题及其解决策略间充质干细胞临床实验中的问题及其解决策略【摘要】 人世充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）具有多向分化特性、免疫调剂作用及体外分离培育扩增操作简便，因此国内外多家单位均开展了MSC临床实验，以预防和医治异基因骨髓移植后移植物抗宿主病，修复骨和软骨损伤，医治心肌梗塞和肝脏损伤等多种疾病。但是，愈来愈多的资料提示，在制订临床应用方案及具体实施进程中，必需考虑到细胞培育用动物血清蛋白的内在化、植入细胞体内存活和分化专一性等诸多因素。本文综述了临床实验设计中宜注意的问题。 【关键词】 间充质干细胞 Problematic Iss

2、ues in Clinical Trials of Mesenchymal Stem Cells and Unraveling StrategiesReview Abstract With the capacities of multiple differentiation, immunoregulatory activities and easy handling for isolation and culture expansion, human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) have been utilized in clinical

3、 trials for the prevention and treatment of graft versus host disease in allogeneic bone marrow transplantation, repair of bone and cartilage defects and treatment of cardiac infarction and liver injury. However, increasingly experimental data indicate that a great deal of issues, such as intra neut

4、ralization of calf serum proteins into cultured MSCs, survival of engrafted cells and subsequent cell differentiation tendency, should be in stringent consideration before clinical trials are designed. In this paper, these issues that should be raised and solved in clinical trials with MSCs were rev

5、iewed . Key words mesenchymal stem cell; clinical trial 间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一群存在于骨髓、脂肪、骨实质、胎盘及骨骼肌等多种组织中的干细胞，具有向骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化功能1。另外，在适当的诱导下，MSC可分化为肌肉细胞和神经元样细胞2。也有报告自称， MSC分化能力接近于胚胎干细胞，能够分化为上皮细胞、内皮细胞和肝脏细胞3-5。研究已经证明，MSC支持体外造血并增进造血细胞体外扩增6；同时，在体外MSC本身不引发异体T细胞活化，且抑制由非特异性丝裂原或异体淋巴细胞激活的T淋巴

6、细胞增殖7，8。通过密度梯度离心分离低比重细胞（比重 g/ml），利用MSC的贴壁生长特性，从人骨髓中分离MSC的技术已经成熟9。细胞在体外增殖旺盛，一样而言，获取5 ml骨髓分离细胞，体外培育4-6周后可取得108以上MSC。因此，MSC在造血细胞移植、器官移植、骨和软骨组织修复、心肌梗死和肝脏损伤中具有潜在的应用价值，某些医治方法已经进入临床试历时期。目前，美国国家食物药品治理局（Food and Drug Administration, FDA）已经批准MSC输注进入II期临床实验，以期减轻异基因骨髓移植中的移植物抗宿主反映（graft versus host reaction, GVH

7、R）。另外，FDA批准的有关MSC细胞医治的临床方案包括：MSC静脉输注医治Crohn病；MSC局部应用医治牙周疾病；MSC静脉输注医治心肌梗死；MSC修复半月板及G CSF动员的骨髓MSC医治心肌梗塞等。国内的临床研究中适应证的选择更为普遍，利用自体或异体MSC预防或医治GVHD、心肌梗死、骨或软骨缺损、糖尿病足坏疽、肝脏损伤或股骨头坏死等，多家单位的研究已经进入临床试历时期。可是，必需指出的是，有些临床实验尚需要充分的理论支持，有关MSC体外培育体系的标准化和体内存活及分化趋向等，仍需要通过严谨的实验进一步说明。本文将提出相关问题，并对相应解决策略进行讨论。 人骨髓中MSC的含量很低，因此

8、临床应用前必需进行细胞的体外扩增。目前国内外移植中心或实验室所报导的人骨髓MSC分离方式，均基于MSC的贴壁特性去除其它细胞，MSC增殖为由纺锤形细胞组成的致密贴壁层。持续传代本身确实是细胞纯化的进程，由于MSC的增殖优势，血细胞和内皮细胞随着传代培育而被剔除，同时MSC进入指数扩增时期，最终细胞扩增达1亿倍以上。可是，由于初始接种细胞成份不同，培育体系组成的不同诸如血清浓度及血清种类不同和细胞因子的添加与否及添加成份等等，这些都可阻碍最终细胞产品的纯度和具体功能。事实上，将单个MSC接种于常规培育体系中，使之形成成纤维细胞集落形成单位（colony forming unit fibrobla

9、st，CFU F），集落内细胞形态均一，细胞表达到骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞等多种系列特异性的mRNA。因此，体外培育的所谓MSC只是一个形态和表型相对均一、分化潜能和所处发育时期迥乎不同的细胞群体10。 另外，培育中的人骨髓MSC细胞间的体外增殖能力和植入能力也有专门大不同。David等11发觉，形态上体积小而增殖较快的细胞，在体外培育初期有很强的自我更新能力，细胞倍增速度快；而体积大的细胞增殖速度那么较慢。Stro 1阳性细胞可能更易于植入骨髓、肌肉、脾脏等组织，而阴性细胞易于滞留于肺循环12。 到目前为止，人们尚未成立一种被多数研究单位普遍同意的统一流程，进行规

10、模化的人骨髓MSC分离纯化及扩增。通过系统的实验设计，观看不同种类血清（包括适用于临床应用的人AB血清或血浆）、血清浓度、细胞因子、细胞生长因子、不同培育液乃至不同产地的培育瓶等可能阻碍人MSC生长及分化的多种因素对最终所获细胞功能的具体阻碍，参考“人体细胞与基因医治标准”，成立适合临床应用的人MSC分离培育标准操作规程。 动物血清蛋白内在化 必需指出的是，目前普遍应用的人骨髓MSC培育体系多采纳胎牛血清，而残余的胎牛血清本身可引发严峻的免疫反映。在体外培育进程中，细胞的吞噬作用使牛血清中的蛋白分子细胞内在化，即便通过洗涤也不能清除牛血清蛋白。一样而言，体外培育收成108 MSC，其残余的胎牛

11、血清蛋白量在7-30 mg之间，多次输注时存在并发血清病的危险13，必然干扰医治成效及其评估。因此，成立一种无异种血清的人骨髓MSC培育体系，是开展相关细胞医治必需的基础。 为此，有人尝试应用血清替代品体系进行人骨髓MSC培育，发此刻无血清体系中，细胞能维持其多向分化特性，增殖速度较传统体系下更为旺盛14。可是，血清替代品中多含有牛血清白蛋白，它是要紧蛋白质成份之一，无血清培育体系虽能保证细胞培育批次及实验室间的稳固性，仍不能从全然上解决异种蛋白内在化问题。采纳自体血清或血浆，或许是解决这一问题的全然途径15。另外，利用人AB血清或血浆进行细胞培育也往往能达到扩增骨髓MSC的目的。 MSC的植

12、入与存活 在骨和软骨组织构建中，MSC是修复骨/软骨缺损理想的种子细胞。实际应用中，常将自体骨髓MSC接种于必然大小和形状可降解生物材料上。这些材料要紧成份有多聚乳酸、多聚乳糖酸或羟基磷灰石。以后，将含细胞的生物材料植入机体组织缺损部位。细胞在局部微环境的诱导下能较为特异地向某一组织分化，而生物材料慢慢被机体吸收或自发降解。新生组织通过重塑后，即可形成完整的组织结构，损伤组织的功能得以恢复。 但是，MSC植入后离开了特殊的培育环境，而通过微循环渗透方式所获营养成份所及的范围在100-200 m之间。因此，植入细胞大部份因营养缺乏而专门快死亡，细胞并非能发挥其增殖分化功能。从已有的动物实验研究资

13、料看，单纯应用MSC复合生物材料，不能专门好地修复较大的骨缺损16。临床实验长期随访发觉，也有部份病例显现骨吸收现象。因此，通过基因修饰或配伍应用生长因子等手腕，增进植入细胞的存活和定向分化和新生组织血管形成，可能是解决MSC作为种子细胞在骨组织修复中生存的有效途径。 在设计MSC医治其它疾病如GVHD、心肌梗死等的临床方案时，也要面对细胞植入和存活率问题。目前人们普遍以为，静脉输注的骨髓、外周血动员或体外培育MSC，只有极少数MSC能植入受者体内，多数细胞滞留于微血管处而死亡17。体外培育的MSC并非是表型和功能均一的细胞群体，Stro 1阳性细胞可能更易于植入骨髓、肌肉、脾脏等组织，而阴性

14、细胞易于滞留于肺循环12。因此，提高MSC抗击低营养的能力，或探讨适合的细胞亚群进行输注，可能是提高MSC体内植入效率，从而发挥体外近似的效应。 MSC的分化特性与医治目的的一致性造血重建是确信一群细胞是不是含有造血干细胞的重要标准。以此推论，如能通过移植手腕达到间充质组织重建，即能够为某一群细胞内含有MSC。但是，成体内MSC含量极低，在骨髓中约为造血干细胞含量的1/10，通过输注动员的外周血或骨髓移植物的方式，不能将足够量的供者源MSC移植给受体。更为重要的是，由于成体间充质组织更新代谢水平较造血组织低，可能更高比例的间充质干细胞处于G0期，不易被常规剂量的放射或化疗药物所清除。因此，组织

15、重建不适合于对MSC的判定。目前，确信MSC的“金标准”都成立在体外实验的基础上，即细胞自我更新能力和多向分化特性，包括形成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力18。在体外实验中，MSC很难向具有功能（而非表型鉴定）的神经元19、肝脏细胞和肌肉细胞20分化。因此，通过自体或异体MSC输注，医治神经损伤、肝脏损伤或心肌梗塞等疾病，似乎缺乏详尽的理论支持。 可是，局部或静脉输注MSC医治非中胚层组织损伤，也可能具有必然的成效。其机理可能体此刻以下几个方面：MSC能够分泌大量的增进细胞增殖分化的因子，如肝细胞生长因子、神经细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子等21；MSC与损伤细胞的融合，可部份发挥某一特

16、定细胞的功能；MSC的免疫抑制效应减轻了因组织坏死引发的局部炎性反映22。 总之，MSC的多向分化特性、免疫调剂作用及体外分离培育扩增操作简便性，为其临床应用奠定了基础。但是在具体的临床应用进程中，必需注意细胞培育的标准化、植入细胞的存活和细胞固有的分化特性等问题；临床实验设计必需有充分的理论支撑。只有如此，方可为MSC相关细胞医治或组织构建替代医治，找到适合的临床适应证。【参考文献】 1Guo Z, Li H, Li X, et al. In vitro characteristics and in vivo immunosuppressive activity of compact bone derived mesenchymal progenitor cells. Stem Cells，2006; 24: 992-10002郭子宽，刘晓丹，刘晓丹等.人骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞.