微生物检验的质量控制...ppt

1、微生物检验的质量控制,广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心2012年11月,前言,在实际工作中存在许多复杂因素影响微生物学检验，可能给检验结果带来偏差甚至错误，因此必须对影响检验结果的诸多因素采取控制手段保证检验结果的正确性，不断完善微生物检验的质量控制。,主要内容,1 检验人员 2 仪器、设备 3 检验培养基、试剂 4 检验环境 5 采样 6 样品的接收和预处理 7 检验质量 8 校验的执行 9 参考菌株及其保存 10 实验室内外部质量控制 11 检验报告及结果质量控制,1 检验人员,（1）微生物检验不能完全依赖全自动鉴定仪器，检验工作中每一步骤均需要有高度的主观分析和判断能力，与个人

2、的经验、技能和微生物检验基础知识水平密切相关。（2）除要求微生物检验人员必须具备严肃认真的工作态度、精密细致的观察和操作习惯，注重个人卫生外，还必须熟练掌握微生物学检验技术。,1 检验人员,（3）检验人员应执行上岗前培训制度，上岗前培训合格方能上岗操作，还要主动参加学习、培训、讲座，学习新技术，掌握微生物学检验方法、标准及相关法律法规；（4）参与编写测试程序及仪器操作程序，学习质量保证体系知识和计量学基本知识；,1 检验人员,（5）参加各类水平测试和盲样测试，提高检测水平和分析问题、解决问题的能力；（6）微生物学检验室负责人应定期对检验人员进行专业知识和操作熟练程度的考核，提高检验人员的素质。

3、,2 仪器、设备,大型微生物检验室的主要仪器及设备包括：无菌室、微生物自动鉴定仪、微生物快速初筛仪、显微镜、菌落计数器、高压灭菌器、干热灭菌器、离心机、蒸馏设备、培养箱、厌氧箱、水浴箱、冰箱、超净工作台、酶标仪、洗板机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。,2 仪器、设备,要求所有的仪器和设备均应按照生产厂家提供的方法和有关规定正确使用。需要强制性定期检定的仪器和设备，经符合资历的计量部门校准合格后方可使用。对于常用的贵重仪器和设备，在使用前应加以检查，使用后要登记，要做到定期维护，以保证仪器处于良好的工作状态。,2.1 高压灭菌器,（1）操作人员应了解蒸气灭菌的原理并遵守操作规则。（2）放入的

4、灭菌物品不宜放得过挤。（3）使用时，放入生物指示条或化学指示条。（4）生物指标为嗜热脂肪芽胞杆菌的耐受性（121，15min）。（5）灭菌后，再培养观察有无细菌生长。（6）也可采用水银留点温度计进行校准。,2.2 干热灭菌器,（1）应遵守操作规则，放入箱内灭菌的器皿不宜放得过挤，器皿与内层底板不能直接接触。（2）灭菌完毕，不能立即开门取物，须关闭电源，待温度下降至50以下再开门取物。（3）带有纸包装的物品灭菌温度不能超过160。,2.3 培养箱,（1）箱内不应放入过热或过冷的物品，取放物品时，应随手关闭箱门，以维持恒温。（2）如培养物不慎泼洒到箱内，应马上清洁，并采取必要的消毒措施。（3）培养

5、物不宜与培养箱最底层直接接触。（4）必要时，可放入装水容器以维持箱内的湿度。（5）每天记录温度及湿度的变化，观察培养箱内温度与设定温度是否一致。在两次计量周期之间要进行至少一次内部校准。,2.5 显微镜,按使用说明进行操作。使用油镜后先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用沾上二甲苯的擦镜纸擦拭，最后用干净擦镜纸擦干。（建议使用无水乙醇+乙醚）注意防尘，保持清洁、干燥。,2 仪器、设备,实验室需要使用的无菌器具应能正确实施灭菌，无菌器具和器皿有明显标识，以便与非无菌器具和器皿加以区别。,3 检验培养基、试剂,3.1培养基 微生物学检验所用干粉培养基，必须由专业厂家生产，产品质量必须符合有关的质量标准，保

6、存也应符合要求，防止潮解、结块等。干粉培养基易受潮变性，需要重视。一旦变质，不得再使用。,3.1培养基,为保证干粉培养基质量指标，在实际工作中应注意：（1）加强包装的密封性能；（2）使用时尽量缩短开盖时间；（3）干粉培养基一般放在通风、干燥、避光的环境中保存，对于易受潮的品种，启用后宜放入干燥器中保存；（4）由于配制水分不同、启用次数或时间增加，干粉培养基的pH值可能会有所变化，应随时略加调整。,3.1培养基,干粉培养基所要求的理化指标，可以从下面几个方面进行初步检查：（1）干粉培养基应为疏松颗粒状或粉末状，颜色正常、一致；（2）溶解后清彻透明，无沉淀；（3）45时pH值为7.2士0.2；熔化

7、温度70左右，凝固温度为35-40；（4）水分含量符合标准。,3.1培养基,商品化培养基的平皿应对所用培养基做外观检查，如培养基是否开裂、平皿有无破碎、血平板有否溶血、有否冰冻、灌注是否均匀、有否过多的气泡，清晰度和有无污染也需要检查。培养基平皿的制备商必须按照标准随产品附上书面鉴定资料，实验室应将此鉴定书保存一定时期。,3.1培养基,实验室自制培养基应有质量控制，包括：制备数量 制备日期 有效日期 制备者姓名还必须检查：培养基颜色 均匀度 厚度 光洁度 溶血与否 有否过多气泡 是否污染,3.1 培养基,培养基的配制应严格按照标准规定的方法进行操作，并做好配制记录。为保证培养基质量，在配制时应

8、注意：制备培养基必须在玻璃容器、搪瓷缸中进行，如用铜、铁等金属器皿，可能会对微生物生长有毒害作用。配制培养基时应按检验项目规定的配方添加，不得随意增减或更改培养基成分。,3.1 培养基,使用专用的角匙取药品，避免交叉污染。使用蒸馏水或去离子水配制，不得使用自来水，因其中含有氯等抗菌物质。不同类型的微生物对pH值的要求不同，配制培养基时应测定pH值，如测定结果与所要求的pH值不符，则用lmol/L NaOH或lmol/L HCl溶液进行调节。,3.1 培养基,制备好的培养基应及时使用，使用不完的，如无特殊需求，可室温或2-8冷藏保存。如用塑料袋密封，保存期可延长，发生变质等被污染迹象或干裂现象的

9、则不能再使用。,表1 培养基在2-8冷藏条件下保存的有效期,3.1培养基,每批自制培养基必须做无菌试验和规定的质控菌株测试，对各种不同培养基规定了专门的质控测试菌株。无菌培养试验可将灭菌后的培养基放入37的培养箱培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。,3.1培养基,效果试验是指按不同的培养基接种相应的菌株，观察细菌的发育、菌落形态、色素、溶血等特征，据此判断培养基是否符合要求。,3.2 检验试剂及药品,检验药品、试剂须在分析纯(AR)级以上。在利用药品、试剂配制标准溶液、染色液、缓冲液及其他试剂时应注意：(1)按要求选取溶剂；(2)用带塞的试剂瓶盛装；(3)易分解的试剂宜用棕色瓶；(4)挥发性

10、的试剂其瓶口应予密封；(5)如发现溶液有变质现象，应停止使用；(6)标准溶液应定时标定。,3.2 检验试剂及药品,实验室内保存的试剂应定期进行清点，过期或变质的试剂应弃去；注意试剂在保存条件下的使用有效期以及最佳保存方式。,3.3 染色液,染色液配制后，必须选用适当的标准菌株作阳性及阴性对照来鉴定染色液的性能，如革兰氏染色选用枯草杆菌、葡萄球菌和大肠杆菌作为对照，鞭毛染色液采用普通变形杆菌和福氏志贺氏菌作为对照。对经验不足者，每次染色时均应作对照染色。,3.4诊断血清,沙门氏菌属、志贺氏菌属、致病性大肠埃希氏菌等诊断血清，使用时应注意有效期及效价。每月用相应的菌株检查其有效性，过期血清和变混浊

11、的血清不应继续使用。诊断血清一般放普通冰箱内保存，使用时应以最短的时间暴露于空气中。最好备有两个生物制品研究所生产的诊断血清，以便互相对照，检查其可靠性。,4 检验环境,微生物学检验均在检验室进行，既不能让微生物散布出去，又必须使样品不再受污染，更不能允许病原菌感染检验人员，为此，检验室的环境要求和卫生管理制度非常重要。实验室总体布局和各部位的安排应减少潜在的对样本的污染和对人员的危害。,4 检验环境,微生物学检验室要求内外环境整洁，布局合理，操作区域与办公区域分开。洗涤室、培养室、消毒间、无菌室应分开，设有专室。无菌室要设有套间或缓冲间，最好设推拉门，以防空气振荡过大。微生物检验室应备有自动

12、或脚踩式洗手池和固定的消毒设施。,4 检验环境,微生物检验室应制定合理、完善的卫生管理制度，工作人员必须每天坚持做好环境卫生工作，防止灰尘飞扬，定期对操作环境进行消毒。对经培养后的培养基、培养液、用过的检样及其他废弃物，应投入指定的容器内，经无害化处理后方可排放，禁止乱扔乱放，以防某些病原微生物散布。,4 检验环境,对需在无菌条件下工作的区域应以明确标识并能有效地控制、监测和记录；检验人员应待无菌室过滤净化装置开机0.51h后，再进入无菌室工作；每天记录环境检测报告，并经常进行空气落菌实验：空气落菌以营养琼脂开上皿15min后盖上盖子，361培养48h计数；定期对无菌室进行室内环境消毒，空气消

13、毒可采用甲醛熏蒸法，甲醛与高锰酸钾比例2:1。,5 采样,（1）采样工具和容器宜选用耐消毒灭菌的材料，如玻璃、陶瓷、搪瓷、铝、不锈钢等，使用之前应进行认真清洗、干燥和相应的灭菌处理。采样工具和容器不能用消毒剂消毒，样品中也不得加入防腐剂，以免影响检验结果的正确性。（2）在严格无菌操作的条件下，按国家规定的样品采集标准均匀而准确地取样，并及时封口，使样品具有准确性和代表性。,5 采样,（3）每件样品封口后，贴上标签，做好记录(如样品名称、采样地点、时间、数量、储藏情况、采集或送检单位及姓名、采样现场温度、湿度及卫生状况等)。采集后的样品，一般可保存在2-8的环境中，如果样品是冷冻食品，应保持在冷

14、冻状态，并及时送检。（4）采样数量不能少于全部检验需要量的3倍，以供检验、复检、备查。,6 样品的接收和预处理,样品送达实验室时，应检查样品标记是否与样品相符，样品包装状况是否正常。若存在下述情况，应考虑拒收样品：（1）抽样后样品送达实验室的时间太迟，使其不能在规定的时间内进行检验；（2）样品温度太高；（3）在转运中样品遭到破损或受到污染。,6 样品的接收和预处理,若对这些样品进行分析，应将情况记录并在分析报告中加以说明。检验前，冷冻食品应在最高温度为4下解冻，不超过18h；较小、易解冻的样品可放置于最高温度为37的恒温箱内最长达15 min。,6 样品的接收和预处理,微生物学检验室在收到样品

15、后，必须及时准备条件、组织力量进行检验。送检的样品，一般需保持在28的环境中，对于冷冻食品应保持在冷冻状态，直到检验为止。,6 样品的接收和预处理,冻藏的样品应尽快放在冷藏的温度下解冻，亦可放在适宜温度(37)下短时间(15min)使其解冻，但温度必须较低，以防止病原菌死亡。冻结样品化冻时，必须小心放置于细菌生长温度之下以免使细菌数量增加。从容器中取出样品、称取样品应注意无菌操作。,7 检验质量,除按国家标准方法对所需检验项目进行检测外，在实际工作中还应注意以下几个方面，否则会影响检验结果的准确性：,7 检验质量,（1）在定量检验时用重量法还是用体积法，检验结果会有误差，因为比重不等于1的样品

16、，1mL和1g的检验结果绝不会相等。一般固态的样品宜用重量法，液体样品宜用体积法。但对于粘性液体(如酸牛奶)，如用体积法，会粘附一定量的样品在吸管上，因此此类样品最好用重量法。,7 检验质量,（2）如检样需用无菌水或无菌生理盐水稀释，则最好用匀质器或组织捣碎机，以800010000转/min的转速处理1min，制成均匀的菌悬液。,7 检验质量,（3）样品稀释时，常会滞留少量样品在吸管内外，应多加注意。吸管插入样品或稀释液中应深浅一致，否则会影响检验结果；吸入液体后，应沿管壁慢慢注入递增的稀释液中，特别注意此时吸管尖端切不可碰到稀释液中。,7 检验质量,（4）在培养基倾注入检样、菌悬液时，注意培

17、养基温度宜在45-50之间，并使培养基与检样、菌悬液充分混合。（5）微生物培养时，应根据要求选择正确的培养温度和时间。,7 检验质量,（6）应用无菌水或无菌生理盐水作空白对照，如果在空白对照中检出细菌，则可认为培养基质量存在问题或在操作过程中存在污染情况。另外，采用标准菌种作阳性对照，观察培养基的质量情况。,7 检验质量,（7）整个检验过程应严格遵守无菌操作。（8）及时检查结果，做好原始数据记录。,8 校验的执行,仪器设备档案应包含以下内容:（1）仪器名称、编号、启用日期。（2）常规校验的方法和校验周期。（3）可以接受的操作范围。（4）仪器功能上的缺陷，如有克服缺陷 的步骤应详细列出。（5）常

18、规维修的日期(按制造商的推荐意 见)。,8 校验的执行,仪器只要不报废，维修记录均应保存。实验室应预先制定仪器校验计划，并按计划对需要强制性定期检定的仪器和设备经符合资历计量部门校验，根据校验结果决定对仪器设备继续使用、降级使用或停止使用。,8 校验的执行,实验室可根据需要对部分仪器进行自校以节约成本，但用于自校的计量工具必须经过计量部门校准方可使用。,9 标准菌株及其保存,标准菌株可以从国际菌种保藏中心（ATCC）、国内具有资质菌种保藏中心（CMCC、AS、MIG等等）或室间质控活动中获得，准确鉴定过的分离株也可使用。实验室要准备好足够种类和数量的标准菌株，满足培养基、试剂盒和试剂质量测试的

19、需要。,标准菌株的保存,保存菌株要定期传代，注意无菌操作，使菌株不污染、不死亡、不丢失；应设专人妥善保管，菌株保存箱应加锁放置适宜环境，取出使用应登记；,标准菌株的保存,保存菌株应建册登记，基本项目应包括菌种名称、分离来源、分离日期、传代日期、保存方法、主要性状、保管者、领用者等；对保存菌种，经传代数次后应进行一次系统生化反应、血清学特性等生物学性状观察，检查其是否发生变异。,标准菌株的保存,常见的参考菌株保存方法如下：,细菌,(1)营养要求不高的需氧细菌在胰胨大豆琼脂斜面上能存活1年。(2)需氧或厌氧菌的长期储存需冷冻干燥，或存放在-70冰箱。(3)营养要求不高的冻干菌种每隔5年要解冻分离重

20、新冻干，好氧菌每隔3年重新冻干。(4)细菌低温冰冻保存时可悬浮于消毒去脂牛奶、含15%甘油的胰胨大豆肉汤或无菌马血中。,真菌,(1)酵母菌按营养要求不高的细菌同样处理。(2)霉菌在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面上，于4储存可达6个月，斜面上覆盖消毒石蜡油可在室温下较长时间存放。,10 实验室内外部质量控制,10.1 内部质量控制 为保证实验室连续评价结果的可靠性和精密度，必须对所用方法的重复性及再现性定期测定。对于不同的控制系统，实验室必须建立限值，超过限值应采取纠偏措施。,10.1 内部质量控制,实践中内部质量控制可包括：（1）系统地使用一式双份的菌落计数测定；（2）由同一检验人员和几个检验

21、人员作平 行样；（3）定期或不定期进行盲样测试。（实验室内部比对试验）,10.2外部质量控制,实验室应参加外部的质量控制活动，对其开展的每一项检测均应参加相应的室间质量控制。（实验室间比对）对有关实验室或管理机构发出的测试样品应严格地当作普通样品一样处理，这样一种方法有助于实验室每天测试的准确性和重复性，是对实验室所用的方法、试剂、设备和人员能力的测试。实验室能力验证（CNAS、CNCA、CMA等组织的比对试验）,10 实验室内外部质量控制,从室间样品测试中的错误可以发现实验室的不足之处，对工作人员进行培训、教育，可以提高实验室的检测质量。对反馈的室间测定评级中存在的问题应当召集全体人员讨论，

22、改进措施(包括方法的改变、员工的改变、员工的再训练、培养基和试剂购买来源的更换等)应当记录在案。,10 实验室内外部质量控制,某些项目缺少室间质量控制，实验室可以设置室内质量控制，每半年自行评估一次。经常参加微生物实验室室间质控活动，有助于加强检测人员的基本功训练，增强样品检测过程中“量”的概念。实验室间的质控可在国内外范围进行，有能力的实验室应力争参加国际间质控活动，以树立良好的检验信誉。,11 检验报告及结果质量控制,对原始数据进行整理，用回归分析法和方差分析法进行处理，去除不必要的误差，获得准确的数据。编制微生物学检验报告可考虑引入不确定度概念。,11 检验报告及结果质量控制,原始数据要

23、求：主题明确符合检样要求和分析目的；内容准确定性判断和定量计算应准确 无误；文字简明文字、表格简洁明了，表达 适当；书写清楚菌类名称(学名)、有关数字及其它 文字说明必须书写清楚。,11 检验报告及结果质量控制,应注意检验结果应与卫生标准的表示方法一致，定量检测以N10n表示，不宜用基数字表示，N为两位有效数字；对定性检测的报告，一定要用汉字“阳性”或“阴性”表示。,11 检验报告及结果质量控制,上述的微生物学检验报告，必须经过规定的手续进行复查，并对照各类标准对微生物学质量进行全面准确的评价和作出合理的解释。有关人员签字后，加盖检验单位印章，以示生效。这样，才能使检验结果既有法律依据又有学术依据。,结语,微生物检验的质量控制比较复杂，目前尚无统一规范，国内各实验室条件参差不齐，开展此项工作任重道远。微生物检验的质量控制要日臻完善，有待广大微生物检验人员共同努力。,谢谢！,