醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究.docx

1、醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属30，又名醋酸细菌。醋酸菌的细胞一般为杆 状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在 0.60.8 X.03.0 ym。醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类， 一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端 生鞭毛。醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、 葡萄或酸败食物表面中都有生长31。醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。醋酸菌在发酵过 程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且

2、还有醇类 32。本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实 验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。试验主要仪器设备型号及产地如表 2.2.1a表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱PYX-250S-A长沙科技双目生物显微镜BME (BA/E3 )科力仪器分析天平BS224S德国来卡手提式不锈钢蒸汽灭菌锅DSX-280B北京化丰超净工作台SW-CJ-1FD上海南鹏精密数子式酸度计PHS

3、-3C上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇（95%）、CaC03、（NH4）2SO4、 K2HPO4、KH2PO4、MgSO4 7H2O、FeCb、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯； 琼脂食用级。2.2.2培养基33-37表2.2.1. b培养基成分表Tab 2.2.1. b Medium composition名称踰糖酵母膏无水乙醇（v/v）琼脂CaCO3备注基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5分离培养1%1%3%2%2%pH自然斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然液体保臧培养基1%1%1%pH自然改进后的斜面液体保臧培养基1%1%3%2%1%pH自然发酵培养基1%1%

4、7%pH 4. 5Horyer-Frateur 培养基3%pH自然GYC 培养基10%5%2%2. 5%pH自然冋糖培养基30%1%2%2%pH自然生酮培养基3%2%甘油3%产5-酮基葡萄糖酸(11)土卜拉K甘培 口养基3%1%2%2%pH自然(12)i7 亦公 * -H-1%1%2%乙酸钙1% pH氧化乙酸培养基7.2乳酸钙2%(13)氧化乳酸培养基1%1%2%pH7.0-7.2乙醇培养基1%3%2%pH自然注：培养基在斜面保藏培养基上， 30 C培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口 2cm处，密封冷藏；培养基其他成分有 （NH4）2SO40.1% ,K2HPO4

5、0.1% , KH2PO40. 01% , 0.025% , FeCb0. 0005% ;以上培养基均以 121C 灭菌 20 min。2.2.3醋酸菌的分离纯化2.2.3.1分离纯化实验称取醋醅样品5g,液态增殖培养48h后，按照浓度梯度10-6、10-7和10-8, 涂布在分离培养基上，培养 2d 后，挑取平板上单个透明圈大的菌落。 连续在平板上培养 3 次，观察其菌落形态是否一致， 选取透明圈又大又清晰 的单菌落，转接并保藏于4C的冰箱。2.2.3.2革兰氏染色实验将上述活化后的菌株，接种于新鲜的培养基培养24 h,制作水晶镜片进行革 兰氏染色。2.2.3.3产醋酸定性实验 38取活化好

6、的斜面菌种，分别接种于基础培养基中，并加入 3% (v/v) 的无水 乙醇，32C震荡培养60 h,取少量除去菌体的培养液，用NaOH溶液(2.5 mol/L) 调节pH至7.0,加入56滴5% FeC3溶液，产醋酸细菌会形成红褐色沉淀。根据 2.2.3.3试验和 2.2.3.4试验结果，筛选出革兰氏阴性且产醋酸的细菌 39 为醋酸菌。2.2.3.4醋酸定量实验经过初步筛选后，把所得菌株接种至发酵培养基中，在 32C、140 r/min恒温震荡培养60 h后，检测其发酵液中总酸，每株平行 3组。醋酸定量测定 40：精确吸取发酵液2 mL至250 mL三角瓶中，并加入蒸馏水50 mL，滴加12

7、滴 0. 5%的酒精酚酞溶液，用已标定过的 0.1 mol/L NaOH 溶液滴定至微粉色。产酸量(g/L) = (V-V 0) CNaOH 60/样品毫升数； 式中：V=发酵液样品滴定耗用的NaOH毫升数；V0=以空白培养基为对照滴定耗用的 NaOH毫升数；CNaOH=NaOH 溶液的浓度 (mol/L)；60 为醋酸分子量。2.2.3.5耐酒精能力实验初筛所得的菌株， 分别接种到含有无水乙醇的基础培养基中培养， 无水乙醇 体积分数从5%到14%，每个梯度相差1%，32E恒温培养3d，观察其是否生长， 筛选出耐酒精性能好的菌株。2.2.3.6传代稳定性实验 41将上述所筛选出的菌株，每隔一个

8、月，转接纯化后的菌株，连续转接培养 7 代，并测定其酸度，来判断、筛选，传代最稳定和产醋酸最高的菌株。2.2.3.7不同保藏方法保藏醋酸菌的存活期限实验 43将传代相对稳定性的菌株，分别按照培养基 2.2.2中的、转接，待斜面上菌苔丰厚，保藏于 2C4C的冰箱内，每隔三个月再次转接，并观察其 存活情况。2.2.4 菌种鉴定实验 44-452.2.4.1培养实验观察通过平板培养， 观察菌落形态特征， 并挑取单个菌落制做水晶片， 革兰氏染 色，同时在 1000 倍光学显微镜下观察其细胞形态、大小和排列特征。2.2.4.2培养特征实验观察所选菌株在平板上培养的情况；观察所选菌株是否能在高糖培养基上生

9、长；观察所选菌株是否能在 Hoyer-Frateur 培养基上生长。2.2.4.3生理生化实验 46接触酶的试验：在长势旺盛的平板上，滴加3%的H2O2，观察有无气泡产生。以铵盐为唯一氮源的生长试验：观察在培养基2.2.2中中生长情况。GYC培养基产色素试验：观察在培养基2.2.2中上能否生成棕色的水溶性色素。生酮试验 (甘油生成二羟丙酮的试验 )：在培养基2.2.2中上，将费林液注满平板，观察菌落周围是否有红色沉淀 出现。产 5- 酮基葡萄糖酸盐试验：在培养基2.2.2中(11)上，32T培养24 h后,观察菌落周围是否有白色不透圈。葡萄糖产酸试验：观察培养基指示剂是否变色。产纤维素试验：在

10、含糖培养基上向菌落上滴加 Lugol 碘液和 60%硫酸液，观察菌落周围变化 情况。氧化乙酸的能力试验：在培养基222中(12)上，32C培养48 h，观察菌落周围是否出现乳白色的晕 圈。氧化乳酸的力试验：在培养基2.2.2中(13)上，32T培养48 h,观察菌落周是否出现乳白色的晕圈。 在以乙醇为唯一碳源的培养基上，观察其能否生长。2.2.5 发酵条件实验发酵温度单因素实验以培养温度为梯度，26C、28C、30C、32C、34C、36C，将筛选所得的 菌种，分别接种于装有 100mL 醋酸菌发酵培养基的 500mL 三角瓶中，置于 180r/min的恒温摇床培养72h，以产酸量和醋酸菌数来

11、确定最佳生长条件。将筛选所得的菌种， 分别接种于分离平板上， 观察出现透明圈的时间， 确 定最快产酸时间。2.3结果与分析2.3.1 分离筛选分离纯化：从分离平板中挑选出107个单菌落菌株。初步筛选：通过醋酸菌分离培养基筛选，选出 44个单菌落产酸菌株。复筛：又经革兰氏染色和醋酸定性试验，淘汰了革兰阳性及不产醋酸的菌 株，选出 4 株醋酸菌株。产酸定量试验，筛选出产酸量大最快的菌株，结果见下图 2.3.2 .A图2.3.1.A 4株醋酸菌产酸量测定Fig 2.3.1.A Four stra ins in determ in ati on of acid acetic acid bacteria

12、耐酒精能力试验，筛选出耐酒精性能好菌株，结果见下图 2.3.2.B图2.3.1.B 4株醋酸菌耐酒精测定Fig 2.3.1.B 4 of acetic acid bacteria resista nt to alcohol determ in ati on然后继续对2株性能较好菌株进行传代培养，确定其传代的稳定性。每 代产酸量见下表2.3.1a表2.3.1.a 4珠醋酸菌传代培养每代产醋酸的测定 (g/L)Tab 2.3.1.a 4 strains acetic acid bacteria in each generation nestin)cultivati ng the determ in

13、 ati on of acetate(g/L)菌株号X1X2X3X41代38.230.931.341.82代39.431.531.543.43代38.330.430.142.34代37.427.326.340.65代35.127.922.738.76代30.624.119.536.97代28.421.814.735.5由表2.3.1.a可以看出，每代发酵培养中，菌株X4的醋酸产量最高，并在传 代培养过程中产量稳定，故选该菌株为目的菌株。存活期限试验：把X4菌株接入三种斜面保藏培养基，每隔三个月接种到各方法所用的培养 基上。观察其存活情况，见表 2.3.1.b:表2.3.1.b三种方法保藏醋酸菌的存活时间Tab 2.3.1.b Three methods of acetic acid bacteria survival time of biomaterial时间/月3691215182124斜面法+液体法+ + + + + +改进斜面+ + + + + + + +注：“ +”表示生长； “ +”表示生长良好；”-”表示不生长。从2.3.1.b看可以出，普通斜面保减法保藏的保藏时间小于 3个月；而液体 保藏法的