芥子油苷测定方法.docx

1、芥子油苷测定方法高效液相色谱对芥子油苷的提取和分离I 准备阶段： 1. 水浴锅设置80 2.配制两瓶70%的甲醇，其中一瓶置于水浴锅中温浴。 3.5mM苄基芥子油苷.2.33mg/ml 4.0.5M醋酸盐（PH=5）30mlHAC，960ml H2O，加10-20g NaOH粉末，调至PH=5 5.20mM的醋酸盐，PH=5：将4中的稀释25倍 6.DEAE sephadex A-25：称取3g 树脂，加90ml 0.5M 醋酸盐（PH=5）室温过夜溶解。 7.硫酸酯酶：15mg溶解于6ml 20mM 醋酸钠中，PH=5（16100uM/hour/g）II 芥子油提取 1. 取新鲜莲座叶，鲜重

2、5-10mg 2. 放入1.5mlEP管中，迅速放入液氮。 3. 研磨成粉末后并加入1ml 预热的70%的甲醇。 4. 加入50ul 5mM 的苄基芥子油苷 5. 盖好盖子漩涡震荡置于冰上，剩下的样品重复步骤3-4。 6. 所有的样品置于8010min。 7. 4000rpm，10min。 8. 将上清液转移至1.5 的离心管。 9. 用预热的甲醇重新提取两次，收集所有的上清液至4ml，-20保存。III 芥子油苷的脱硫纯化 1. 搅拌DEAE sephadex A-25 树脂成溶液，用1ml的移液器取1ml加入BioRad 管中，让其沉淀。 2. 用5ml 的灭菌水清洗（禁止干燥）。 3.

3、加入所有的芥子油苷提取液。 4. 用2ml的70%的甲醇清洗两次，2ml 的灭菌水清洗5次，2ml 20mM 醋酸盐PH=5清洗一次。 5. 加入0.5ml 硫酸酯酶，直至上侧的橡胶管中剩余1-2mm的液相。IV 脱硫芥子油苷的洗脱 1. 用1ml 灭菌水洗脱3次。 2. 浓缩至EP 管中剩余0.5ml 液体V HPLC分离脱硫芥子油苷 1. 取60ul 洗脱液于HPLC管中，吸入30ul 2. 检测：PDA 190nm-370nm （或者DV229nm和260nm） 3. 流速：1ml/min 4. 运行梯度：灭菌水（A）和甲醇（B），60min A100%,B0% 2min A to 60

4、%B线性 48min，60%B to 100% B 线性 3min A 0%，B100% 3min B to 100% A 线性 4minVI 芥子油苷的HPLC-MS 5. 取60ul 洗脱液加入HPLC管中，吸入6ul 6. 检测：质谱，M+Na+ 7. 流速：0.25ml/min 8. 运行梯度：混有50uM的醋酸钠灭菌水（A）与甲醇（B），60min A100%,B0% 2min A to 60%B线性 40min，60%B to 100% B 线性 5min A 0%，B100% 5min B to 100% A 线性 8min液相色谱质谱联用分离、鉴定芥蓝中脱硫芥子油苷腊贵晓,方萍

5、,李亚娟,王月1.芥子油苷的提取和纯化称取0. 20 g冻干样品,加入3 mL 70%甲醇(甲醇水= 70 30),在70的水浴锅中提取10 min,然后4000 r min- 1离心10 min.沉淀再按照上述方法提取2次,合并上述提取液.同时做2个平行.取2 mL提取液流经DEAESephadex A-25萃取柱,待提取液全部流出小柱后,加入200 L硫酸酯酶(0. 1%)溶液.室温反应16 h后用4 0. 5 mL超纯水洗脱.洗脱液过0. 45m微膜,4下保存,待HPLC分析.利用2-丙烯基芥子油苷(sinigrin)作为外标进行定量.2.芥子油苷的测定与鉴定测定芥子油苷的主要方法包括气

6、相色谱法测定其降解产物异硫代氰酸盐化合物;高效液相色谱法测定脱硫芥子油苷和完形芥子油苷.对芥子油苷的鉴定一般采用质谱法,包括化学电离、快速原子轰击电离及热喷雾电离等方法. 1.超高效液相色谱法测定拟南芥芥子油苷 J东北农业大学学报，石璐，李梦莎，国静等摘 要：将已有的拟南芥芥子油苷高效液相色谱（HPLC）检测方法转换为超高效液相色谱（UPLC）方法，通过条件优化改进，建立拟南芥芥子油苷UPLC检测方法。该方法采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（50 mm2.1 mm，1.8 m），以超纯水和甲醇为流动相进行梯度洗脱，流速为0.40 mLmin-1，检测波长229 n

7、m，进样量5 L，内标为苯甲基芥子油苷。2.芥蓝芥子油苷提取条件优化研究腊贵晓1， 孔海民2， 方 萍3， 杨铁钢1*摘 要:采用正交试验设计，研究了提取温度、提取剂甲醇浓度( V/V) 、提取时间和待测物质与提取液比例( 简称“物液比”) 对芥蓝菜薹中芥子油苷( 总芥子油苷含量、总脂肪族芥子油苷和总吲哚族芥子油苷) 提取效果的影响。结果表明，物液比和提取温度对总芥子油苷、总脂肪族芥子油苷和总吲哚族芥子油苷提取效果影响显著( P005) ，而甲醇浓度和提取时间对芥子油苷提取率无显著影响( P005) 。综合考虑提取效果和成本，芥蓝中芥子油苷最佳提取条件为 75，物液比 145( g mL) ，

8、甲醇浓度 70%，提取时间 5 min。在该条件下，总芥子油苷提取量为831 mol/g DW，总脂肪族芥子油苷提取总量为758 mol/g DW，总吲哚族脂肪族芥子油苷提取总量为073 mol/g DW。3.中国甘蓝型油菜硫苷含量及组份分析 李培武1，2，赵永国2，张 文2，丁小霞2，杨 湄3，汪雪芳3，谢从华1，傅廷栋1 （1）硫苷提取：准确称取0.2000 g 已制备好的样品至离心管中，于75水浴中保温杀活 1 min，加入2 ml 70%甲醇提取液和 200 l 内标，离心、转移上清液至试管中，再加入2ml 70%甲醇提取并离心，共重复 3 次，混合上清液，取 2 ml 溶液上醋酸型D

9、EAE-Sephadex A-25 阴离子交换柱，加硫酸酯酶 500 l，于 36培养箱中酶解 20 h 后取出，用 1 ml 纯水冲洗，待流干后再用1 ml纯水冲洗，共冲洗3 次，混匀收集的洗脱液，用 0.45 m的微孔滤膜过滤、封口，待上液相色谱仪分析。 （2）高效液相色谱分析：使用美国 Waters 公司的液相色谱仪，包括两台高压泵，自动进样器，二极管阵列检测器，色谱柱为 Spherisorb C18柱（150 mm4 mm），流动相为 20%乙腈，检测波长 229 nm，柱温为 30，进样量 10 l，所有样品重复 2 次，按照国际标准方法进行硫苷分量色谱峰定性。青花菜： 在青花菜芽菜中共发现了7种芥子油苷，3种脂肪类芥子油苷，S4,S5和T4以及4种“吲哚类芥子油苷”:4OHIM，IM,1IM和4IM.拟南芥中芥子油苷：拟南芥：大白菜：