动物细胞工程.docx

1、动物细胞工程动物细胞工程第一章 动物细胞工程概论一、动物细胞工程的概念 1.动物细胞工程的定义 动物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的技术方法对动物细胞进行各种操作并使其在体外生长、增殖、分化以生产有用产品或引向成体化（产生新型生物个体）的技术体系，是生物技术（生物工程）的重要组成部分。狭义细胞工程指对细胞个体进行的各种操作，广义的细胞工程包括对细胞、组织、器官所进行的各种操作。 2.动物细胞工程研究的主要内容 以狭义细胞工程为主，兼顾组织、器官工程等内容的研究。 (1)狭义细胞工程 ：研究体外分离、培养、增殖、分化动物细胞的条件以及保存、操作及利用动物细胞的工艺技术体系。 (2)组织工程

2、：研究体外培养、增殖动物组织的条件以及保存、操作及利用动物组织的工艺技术体系。 (3)器官工程：研究体外培养、增殖器官的条件以及保存、操作及利用动物器官的工艺技术体系。 (4)动物胚胎工程：研究动物胚胎生产、保存、操作及移植的工艺技术体系。3.动物细胞工程研究的意义(1)是动物繁殖的重要技术手段 加快动物繁殖速度：A.体外受精生产胚胎 B.胚胎移植生产动物(2)是人类辅助生殖技术的重要组成部分 体外受精胚胎移植技术，可以克服雄性不育和雌性不孕；(3)是动物遗传育种的重要技术手段 对精子或卵子进行遗传操作，或利用细胞融合、胚胎嵌合技术可以使若干个动物性状进行有机组合，产生新的生物个体； (4)生

3、产药物 直接培养细胞或组织，从细胞或组织代谢物中直接获得药物;对细胞进行遗传操作，生产转基因动物，利用转基因动物生产药物（生物反应器）；(5)保存珍惜动物资源 由于动物克隆技术的成功，保存细胞、组织、胚胎，就意味着保存一个生命个体，保存细胞、组织、胚胎，就意味着保存一个生物种群(6)提供人类器官移植的材料 人类器官移植发展很快，目前可以进行心脏、肝、肾脏移植，可以进行皮肤、角膜、骨髓细胞移植。三、动物细胞工程讲授的主要内容 1.动物细胞、组织培养 2.动物细胞融合 3.动物细胞重组 4.向细胞内引入高分子物质 5.动物细胞冷冻保存 6.动物胚胎工程 四、动物细胞工程实验（实习）内容1.实验仪器

4、设备的识别与使用 2.动物细胞培养用液的制备 3.动物胎儿成纤维细胞分离与培养 4.动物细胞常规检查和生物学检测 5.培养细胞的冻存与复苏 五、动物细胞工程研究取得的重要进展1.精液采集、精液冷冻与人工授精技术的成熟和发展，为充分发挥利用雄性动物生殖潜力奠定了基础；2.雌性动物卵母细胞体外成熟培养技术的成功，使人们在体外完成动物生殖过程成为可能；3.体外受精与胚胎移植技术的成功，产生了试管婴儿，试管牛，试管猪，试管山羊，试管兔；4.细胞核移植技术的成功，使人们克隆高等哺乳动物的梦想得以实现体细胞核移植、胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植技术的成功，为克隆动物和转基因动物生产提供了技术支撑；5.胚

5、胎干细胞与组织干细胞成功分离、体外扩增与诱导分化研究的成功，为人类医学发展提供了宝贵的材料；胚胎干细胞，胰腺干细胞，神经干细胞，骨髓干细胞，皮肤干细胞，角膜干细胞6.转基因细胞（细胞转染基因）技术的成功，为转基因动物的生产创造了条件；7.胚胎嵌合技术 一种或两种动物胚胎共同生长发育形成一个生物个体的技术，即在一个生物体内，含有来源于两个不同胚胎的细胞和组织；8.细胞融合技术 将两种或两种以上的细胞融合，形成一个具有新性状的细胞，这种技术称为细胞融合技术。细胞融合技术为单克隆抗体及其它药物生产，创造了条件；9.细胞重组技术 一方面，细胞核与细胞质互换，研究细胞质对细胞核基因表达及组织发育的影响，

6、另一方面，利用细胞核移植技术生产克隆动物与胚胎，为转基因动物生产创造条件。第二章动物细胞与组织培养概论一、培养的基本概念动物组织细胞1.组织培养（Tissue culture） 组织培养是指从动物体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使动物组织生存、生长并维持其结构与功能的过程。2.细胞培养（Tissue culture） 细胞培养是指从动物体内取出组织，分离获得细胞，并模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使动物细胞生存、生长，增殖并维持其结构与功能的过程。3.器官培养（organ culture） 器官培养是指从动物体内取出器官，模拟体内生理环境，在

7、无菌、适当温度和一定营养条件下，使动物器官生存、生长并维持其结构与功能的过程。二、动物组织细胞培养的作用 1.可以长时间观察和研究活细胞的生命活动； 2.理化环境可以人工控制； 3.遗传性状均一； 4.对外界环境刺激反应灵敏； 5.省费用； 6.为动物繁殖新技术提供理论依据和技术支撑； 7.是动物遗传育种的重要技术手段； 8.为医学移植提供材料：细胞、组织、器官；9.利用细胞培养，生产生物制品（药物如疫苗，抗体）； 10.保存珍惜动物遗传资源； 11.研究生命科学奥秘三、动物细胞在体外培养过程中发生的变化 1.环境不同 2.细胞与细胞联系不紧密 3.细胞容易发生突变 4.细胞群落结构趋于单一性

8、 5.体外培养的细胞与体内细胞相比较，基因组及遗传物未发生改变，但遗传物质的表达发生了改变。 6.形态发生一系列变化 （2小时） （1）从分离到附着 球形（圆形）扁平状（延展细胞）极性细胞（纺锤形、三角形，多角形） （2）细胞器和细胞核集中于细胞中央，胞质外周包裹透明状胶体（细胞骨架） （3）活细胞形态 在光学显微镜下，细胞均质而透明，结构不明显，在相差显微镜下，可以看到细胞轮廓和内部结构，细胞中含有一个或两个细胞核核仁。 （4）弱（死）细胞形态 细胞轮廓增强，细胞质中出现颗粒脂滴和空泡。 7.培养细胞对生存环境要求更严格，更脆弱，由于缺少保护机制和解毒机制，细胞需要无毒、无污染的环境。四、体

9、外培养细胞的类型 1.根据培养细胞生长是否需要支持物，细胞分为两种类型 （1）贴附型细胞： 在体外培养过程中，需要附着在支持物上的细胞，被称为贴附型细胞。如成纤维型细胞，上皮型细胞，游走型细胞（可以移动），多型细胞（神经细胞，难以确定稳定状态）。 （2）悬浮细胞：在体外培养过程中，不需要支持物，需要悬浮在培养液中的的细胞，被称为悬浮细胞。如红细胞，白细胞。 2.根据培养细胞生物学特性，将培养细胞分为：神经细胞、上皮细胞、脂肪细胞、血细胞（红细胞、白细胞）、淋巴细胞、心肌细胞、骨骼细胞、生殖细胞五、组织培养细胞的生长和增殖过程 1.体外培养细胞不同代数指数期细胞生长规律（1）原代培养期 从动物体

10、内取出新鲜组织，分离获得细胞，细胞在体外初次培养生长至第一传代期，细胞开始分裂，指数期细胞数量较少，大多数为异质细胞（不同类型细胞），为2倍体。（2）传代期 当原代细胞在体外培养，密度达到最大，出现片层时，将细胞群消化分离成单个细胞或多个细胞，在体外培养生长至饱和密度的过程，传代期可以持续进行数十代。处于传代期细胞指数期细胞数量最大，细胞生长分裂速度最高。（3）衰退期 有限细胞系细胞开始衰老，分裂增殖能力下降，指数期细胞数量下降的过程。2.同代数细胞分裂增殖规律（1）滞留期 细胞质收缩，呈球形，细胞开始悬浮于培养液，随后，附着性细胞活细胞开始附着，具有代谢与运动能力，但不分裂。（2）指数增长期

11、 细胞分裂旺盛，细胞分裂速度增加，细胞数量快速增加，细胞活力最大，细胞相互连接形成片层。（3）平台期 由于密度增大，细胞相互之间密切接触产生抑制效应导致细胞分裂速度减小，死亡速度增加，细胞数量处于稳定时期，细胞数量达到最大。细胞有活力但分裂停止。（4）衰老期 由于密度制约，养分供应不足，细胞衰老死亡数量增加，细胞分裂速度减慢，细胞数量开始减少。 3.单个细胞生长过程 （1）A 间期 （2）G1期：DNA合成前期 （3）S期：DNA合成期 （4）G2期DNA合成后期，细胞分裂前期（5）M期：细胞分裂期（有丝分裂前、中、后、末期）4.培养细胞生长特点 （1）贴附、伸展 大多数哺乳类动物细胞在动物体

12、内生长分裂发育过程中，需要附着在基质上，体外培养的许多细胞，也趋向于附着在细胞支持物上，如细胞附着在胶原蛋白、玻璃或塑料上。（2）接触抑制 在一般情况下，体外培养的细胞在生长过程中发生分裂和增殖，正常细胞不断运动，其外周细胞膜呈现一些特征性触褶运动，当两个细胞相互靠近时，另一个细胞停止运动并向另一个方向离开，当一个细胞被其他细胞包围不能运动时，细胞膜触褶运动和分裂增殖将会受到抑制。（3）密度依赖性 任何细胞分裂增殖，都需要一定的细胞密度，细胞密度过小，对细胞分裂增殖不利。细胞密度过大，对细胞增殖也不利。细胞密度对细胞分裂增殖的不可缺少的作用称为细胞密度的依赖性。在细胞生活过程中，细胞个体之间存

13、在着形态的和机能的联系，如上皮细胞之间存在桥粒，细胞之间存在着能量、物质和信息交换。（4）细胞基质（Extracellular Matrix：ECM） 细胞基质对于细胞生长、分裂、增殖与分化具有重要的作用。体外培养细胞和定向诱导细胞分化时，必须考虑细胞基质的作用。六、体外培养细胞生存的必须条件 1.环境无污染，无毒 环境无污染、无毒是保证培养细胞生存的首要条件。环境无污染，是指在细胞培养过程中，培养液、培养器皿以及操作各个环节无细菌、病毒以及衣原体等有害物质进入。环境无毒是指在细胞培养过程中，培养液、培养器皿以及操作各个环节无有毒有害物质进入培养系统。2.温度 体外培养的细胞只有保持在一定的恒

14、温条件下，才能分裂、增殖和生长，环境温度过低或过高，都不利于细胞的生长。一般情况下，促使细胞快速增殖的环境温度为动物的体液温度，对于哺乳类动物，体外培养细胞的理想温度是35 37，鸟类动物培养细胞理想温度是38.5。3.CO2和O2 5% CO2 对于大多数哺乳类动物细胞来说是适宜的。4.pH值 大多数细胞适宜于在7.27.4条件下生长，PH值低于6.8，高于7.6，对细胞分裂增殖都不利。5.渗透压 大多数细胞生长需要一定的渗透压，渗透压对于保持细胞膜的完整性以及维持细胞正常的代谢，具有重要作用。大多数培养细胞所需要的渗透压为260 320mmol/l。七、细胞体外培养所需的营养物质 1.糖类

15、 主要为单糖如葡萄糖2.氨基酸 精氨酸、胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺。3.维生素 维生素A，维生素B，维生素C，维生素D，维生素E，维生素K，生物素4.促生长因子与激素 促进细胞分裂、增殖与分化的蛋白质、类固醇类物质5.矿物质 K、Na、Ca、Mg、P、S，Fe、Cu、Zn、Se、Cr、Mn、Mu6.水 用于细胞培养的水，需要无毒、无菌，一般用二蒸水或四蒸水。八、与细胞工程有关的术语 1.细胞株（cell细胞strain）：形态均一，生长增殖比较稳定，生物性状稳定独特的一群细胞。2.细胞系（cell line）：形态均一，

16、生长增殖比较稳定，生物性状稳定独特的一群细胞，能不断的经过传代而扩增。有限细胞系与细胞株概念类似，可以进行有限次传代而保持细胞生物学特性稳定。无限细胞系是指细胞可以经过无限次数传代而保持细胞生物学特性稳定。3.克隆细胞系：由一个经过鉴定的细胞系中的单个细胞演变、筛选而产生的一群细胞，称为克隆细胞系。4.二倍体细胞：细胞群含有两套染色体。当培养细胞中二倍体细胞占细胞总数的75%以上时，细胞群可以认为是二倍体培养细胞。5.单倍体细胞：细胞群含有一套染色体，一般为动物的生殖细胞，包括精子和卵子。6.细胞克隆：一个细胞经过培养形成结构与功能完全相同的无数细胞的过程，称为细胞克隆。7.细胞核型：一个细胞

17、的染色体按照一定顺序排列的图谱称为细胞核型。8.初代培养：直接从动物体内取出的细胞经过的第一次培养。9.继代培养：当细胞生长使细胞密度处于饱和状态时，对细胞进行分离，接种和再培养过程，称为细胞继代培养。细胞继代培养的主要目的是为细胞增殖创造有利条件以扩大细胞数量。九、影响细胞体外培养效果的因素 1.细胞来源 幼龄易于成年易于老年，分化程度低的细胞易于分化程度高的细胞；2.培养条件 培养液（DMEM、RPMI1640、MEM-F12)、培养温度、添加物(EGF、IGF、HGF）；3.贴附底物 明胶、成纤维细胞（小鼠、人）； 4.分离方法 机械、酶（tripsin、dispase、EDTA）； 5

18、.消化分离时间第三章 动物细胞培养的基本设施与条件 一、细胞工程操作的基本环节 1. 器械、器皿消毒、灭菌以及无菌操作 2. 溶液配制、过滤（灭菌）、保存以及溶液孵育3. 细胞分离、培养 4. 细胞操作 5. 细胞冷冻保存 6. 细胞移植以及细胞使用二、细胞工程常用的仪器与设备1.准备室的实验设备仪器：洗刷设备、蒸馏水仪、干燥箱、高压灭菌锅等； 2.层流室的实验设备仪器：无菌操作间、超净工作台、相差显微镜、细胞培养箱、离心机、离心管、移液器、培养皿、培养瓶、培养板过滤器等； 3.称量室的实验设备仪器：天平、搅拌器、试剂柜等； 4.动物材料准备室的实验设备仪器：手术器械等；5.储备室的实验设备仪

19、器：冰箱、液氮罐等细胞冷冻设备，细胞冷冻管等。第四章 动物细胞培养液 一、培养液概念与种类 1.概念 是指在细胞培养过程中用于细胞和组织洗涤、培养的溶液。 2.培养液的种类 （1）平衡盐溶液：生理盐水、PBS、Ringer Tyrode、earle、Hanks、Dulbecco、D-hanks等； （2）天然培养基：主要来自动物体液或从组织中分离提取制备的溶液，包括血浆、血清、胚胎浸出液、鼠尾胶原、血清代用品等； （3）合成培养基：用人工方法合成的动物细胞培养基，包括DMEM、TCM199、MEM、Hams F12、RPMI-1640等。二、平衡盐溶液 1.作用：稀释或灌注液体，缓冲系统，为细

20、胞代谢提供水分和离子。 2.主要成分：NaCl、CaCl2、KCl、MgCl26H2O、MgSO47H2O、NaHCO3、葡萄糖、NaH2PO4.2H2O、KH2PO4、Na2HPO4. H2O。 3.配制方法：（1）称量溶解难溶药品 CaCl2、MgCl26H2O、MgSO47H2O分别称量，溶解；（2）称量溶解其他药品并溶解； （3）将难溶溶液缓慢加入到易溶溶液中，并缓慢搅动；（4）灭菌：不含有机物的易溶溶液，可以进行高压消毒，其它溶液可以采取过滤的方法去除杂质和细菌。三、天然培养液 1.血浆 （1）作用 为细胞生长提供营养物质，为细胞附着提供支持物，对细胞进行保护。 （2）制备方法 选择

21、健康动物，用肝素抗凝采血，离心，取上清液，过滤，冷藏。 2.血清 （1）作用 提供蛋白质，提供金属离子，提供激素、为细胞附着提供支持物。 （2）种类：兔血清、牛血清、羊血清。 （3）制备方法 选择健康动物，动脉采血，置于含有生理盐水的瓶内，室温倾斜放置1-2小时，待血液凝集后置于4冰箱保存过夜，取上清液，离心（3000RPM）20-30分钟，吸取血清，用之前，过滤。 3.胚胎浸出液 取胚胎，磨碎，加等量缓冲液，混匀、离心，取上清液，于-20保存。 4.鼠尾胶原/明胶 5.血清代用品 水解乳蛋白四、合成培养基 1.概念 利用人工方法合成的用于培养细胞的营养物质。 2.合成培养液的主要成分：氨基酸

22、、维生素、碳水化合物（葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠、醋酸钠 ）、无机离子、其他成分（嘌呤、嘧啶、抗坏血酸、谷胱甘肽） 3.剂型：（1）溶液（2）粉剂 4.溶液配制 （1）称量 准确称量药品，置于烧杯中； （2）溶解 加入无离子水，用磁力搅拌器搅拌，使其溶解； （3）定容 将溶液倒入容量瓶中，加入少量无离子水洗涤烧杯中溶液3-4次，用无离子水定容。 （5）过滤 正压过滤或负压抽滤。 （6）分装 在无菌条件下将溶液分装于100毫升试剂瓶。（7）保存 0-4保存五、 其它常用溶液 1.消化液(1）胰蛋白酶溶液 胰蛋白酶（trypsin）是一种乳黄色的粉末状物质，来自猪或牛胰腺组织，作用于赖氨酸和

23、精氨酸形成的肽键，除去细胞之间粘蛋白及糖蛋白，破坏细胞与基质之间的联系，使细胞分离。作用对象 间质较少的细胞软组织，作用时间过长，对细胞有损伤作用溶液配制 用无Ca2+、Mg2+缓冲液配制 工作条件 35-37 终止作用 用含有血清的培养基终止消化 贮存 0以下保存 消毒 抽滤 （2）EDTA2Na溶液 EDTA2Na 是一种白色结晶状化学物质，是Ca2+、Mg2+的螯合剂，作用于细胞液，与细胞液中Ca2+、Mg2+结合，破坏细胞之间的连接，使细胞解离。 作用对象 作用于上皮组织细胞 溶液配制 用无Ca2+、Mg2+缓冲液配制 工作条件 35-37 终止作用 加入培养液离心，漂洗。 贮存 4-

24、0以下保存。 消毒 高压（3）胶原蛋白酶溶液 胶原蛋白酶（collagenase） 是一种乳黄色的粉末状物质，作用于间质的脯氨酸多肽，使其水解，从而使细胞离散除去细胞之间粘蛋白及糖蛋白，破坏细胞与基质之间的联系，使细胞分离。 作用对象 作用于胶原蛋白含量高的组织，作用时间过长，对细胞有损伤作用 溶液配制 用无Ca2+、Mg2+缓冲液配制 工作条件 35-37 终止作用 加入培养液离心，漂洗。 贮存 4-0以下保存。 消毒 过滤 收获细胞多次进行，每20-30分钟一次。2.PH值调整液 (1)NaHCO3溶液：7.4%，5.6%和3.7%三种，用37三蒸水溶解，定容，过滤，分装。 (2)10%醋

25、酸溶液 高压灭菌、分装。 (3)Hepes溶液：缓冲溶液。高压灭菌、分装。3.L-谷氨酰胺 按要求配制，过滤,分装,保存。4.抗菌溶液 （1）作用 抑制微生物增殖 (2)种类：青霉素、链霉素 卡那霉素5.抗凝剂肝素 （1） 取肝素注射液1支（12500IU），溶于25毫升生理盐水，溶液浓度为500 IU/毫升，使用浓度为10-20 IU/毫升。 （2）称量肝素0.2克，溶于100毫升生理盐水，高压灭菌，贮存，使用时按1%-2%添加。第五章 动物细胞及组织培养一、选取动物与获得材料1.选取动物 健康、无疾病，年龄、性别符合研究需要 2.处理动物 注射药物，如麻醉剂或其他需要药品3.处死动物或固定

26、动物 4.消毒5.剖解 皮肤-皮下组织腹膜器官，在对不同器官进行操作时，应该及时更换灭菌手术器械，防止污染。6.摘取器官 7.洗涤 用灭菌生理盐水或PBS洗涤器官2-3次二、分离组织细胞 1.离心分离法 当培养物为血液、羊水、腹水、胸水、精液等细胞悬液时，可以采用离心分离法，离心速度为500-1000RPM，离心时间为5-10分钟。例如，分离白细胞的程序为：（1）取抗凝血若干毫升； （2）按1：1比例加入无菌分层液后，800-1000 RPM离心（3）无菌分离白细胞 （4）加入BSS液，离心，弃上清液 （5）底层为细胞所要细胞。 2.机械分散法（1）切割分离法 用眼科手术剪将组织块切割成小块，

27、为1mm3，成糊状为止，加入缓冲液，吹打，低速离心，去上清液，余下组织块可以培养。（2）机械分离法 对于动物某些软组织，如脑、胚胎以及肿瘤组织，可以采用剪碎、挤压法分离细胞。 3. 消化分离法（1）切割分离 用眼科手术剪将组织块切割成小块，为1mm3，成糊状为止。（2）蛋白酶消化 将适量消化酶溶液加入到组织小块中，在适当温度（4、25、35）条件下处理若干时间。（3）终止消化 加入含有血清培养液，混匀，离心。 （4）洗涤 加入缓冲液，悬浮细胞，离心。（5）悬浮细胞 加入适量培养液，悬浮细胞。三、细胞计数（实验课讲授）四、细胞接种 1.稀释细胞至所需浓度； 2.将细胞按照一定数量置于培养液中，培

28、养。五、从动物组织初次细胞分离培养工艺体系 1.切碎组织：用眼科剪将组织块剪碎至糊状，组织块约为1mm3； 2.消化组织：加入消化液，在一定条件下消化作用一定时间； 3.过滤：将细胞过滤，组织块重新消化； 4.终止消化：加入一定量含有血清的培养液，终止消化； 5.离心：将消化后细胞置于离心管，1000-1500RPM离心15-20min，弃上清液（加入适量培养液，悬浮细胞，再离心）； 6.悬浮细胞：弃上清液，加入适量培养液，悬浮细胞； 7.计数：用红血球计数板计数； 8.稀释：按要求加入适量培养液，稀释细胞； 9.接种：加入一定量细胞于含有培养液的培养皿或培养瓶中，震荡细胞； 10.培养：将培

29、养皿（培养瓶）置于37-38，饱和湿度，含5%CO2培养箱中，培养； 11.换液：每隔48-72小时更换1次溶液。六、动物组织块培养工艺体系 1.切碎组织：用眼科剪将组织块剪碎至糊状，组织块约为1mm3。2.洗涤：加入洗涤液，用移液管反复吹打在，静置一定一定时间，弃去上清液。3.培养：将组织块置于培养皿（培养瓶）中，加入细胞培养液，将培养皿（培养瓶）置于37-38，饱和湿度，含5%CO2培养箱中，培养。4.换液：每隔48-72小时更换1次溶液。七、细胞传代培养 1.弃培养液； 2.洗涤：加入洗涤液，洗涤2-3次； 3.消化细胞：加入消化液，在室温条件下作用一定时 4.终止消化：待细胞片层开始脱

30、落时，吸取消化液，加入适量含有血清的培养基，终止消化。 5.洗涤细胞：用移液管吹打细胞，离心，弃上清液，加入培养液，再离心。 6.悬浮细胞：加入一定量细胞培养液，吹打细胞，制作细胞悬浮液。 7.接种细胞：将细胞接种到含有新鲜培养液的培养皿（培养瓶）中，置于37-38，饱和湿度，含5%CO2培养箱中，培养。 8.换液：每隔48-72小时更换1次溶液。 第六章 动物细胞组织保存 一、动物组织细胞保存的基本概念 1.细胞组织冷冻保存的定义 利用液氮（-196）、干冰（-79）或其它制冷设备作为冷源，将动物组织细胞经过冷冻保护剂处理，按照一定程序降温，将细胞冷冻长期保存在超低温条件下，以达到长期保存细

31、胞组织的目的。2.冷冻细胞种类：精液、卵母细胞、胚胎、组织、细胞、病毒、真菌3.冷冻保护剂 在细胞冷冻过程中，添加于培养液或稀释液中用于防止冷冻对细胞产生损伤的一类物质，包括甘油、DMSO、DMA、聚丙二醇。二、细胞冷冻保存原理 1.低温保存，延长细胞寿命 在低温条件下，细胞代谢水平降低，消耗营养物质数量减少，细胞生存寿命延长；超低温条件下，细胞代谢几乎停止，可以长期保存。在一定条件下解冻，冷冻保存的细胞仍然保存活力。2.在一般降温情况下，细胞水分形成大的冰晶对细胞产生损伤 在一般情况下，温度下降至冰点以下，细胞中水分形成大的冰晶，产生两种效应，一种效应是细胞中冰晶移动，对细胞膜、质膜和细胞器产生机械损伤，造成细胞死亡，另一种效应是细胞中部分水分形成冰晶，造成细胞局部形成高渗环境，细胞局部脱水，造成细胞不可逆转发生结构变化，引起细胞死亡。3.冷冻保护剂的作用 就在于在细胞冷冻过程中，冷冻保护剂渗透到细胞内，与细胞中的水分结合，限制和干扰水分进行晶格排列，降低冰点，抑制水形成冰晶的速度与体积；冷冻保护剂渗透到细胞内，迫使部分