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1、纤维蛋白支架对人嗅鞘细胞髓鞘形成相关蛋白表达的影响纤维蛋白支架对人嗅鞘细胞髓鞘形成相关蛋白表达的影响(作者： 单位： 邮编： )作者：陈静 黄秋生，窦毅 宗海洋，崔颜宏 庄琴 孙湘兰 龚爱华，张志坚【摘要】 目的：探讨纤维蛋白支架对人嗅鞘细胞髓鞘相关蛋白表 达的影响。方法： 将体外培养的成人鼻粘膜嗅鞘细胞种植于纤维蛋白支架，用多聚赖氨酸修饰的玻片作为对照底物，培养 14天后用扫描电镜观察细胞的形态学变化并对细胞内髓鞘形成相关蛋白 2,3环核苷 3磷酸二酯酶(2,3 cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase ， CNPase )和髓鞘碱性蛋白(myelin ba

2、sic protein， MBP)进行免 疫荧光染色定位和免疫印迹半定量测定，分析纤维蛋白支架对人嗅鞘 细胞CNPase和MBP表达的影响。结果： 人嗅鞘细胞种植于纤维蛋白支架后，其形态为长条带状，细胞成束排列，方向一致。细胞内 CNPase和MBP表达水平明显高于对照组。结论：纤维蛋白支架与 人嗅鞘细胞具有很好的生物相容性并可促进细胞表达髓鞘相关蛋白 CNPase和MBP ;将该组织工程支架用于移植治疗脊髓损伤，有利 于再生神经纤维的髓鞘形成。【关键词】 人嗅鞘细胞； 组织工程支架； 纤维蛋白(原)；2,3环核苷3磷酸二酯酶； 髓鞘碱性蛋白Abstract Objective: To inv

3、estigate the effects of fibrin scaffold on the myelin associated proteins expression of the human olfactory en sheathi ng cells(hOECs) derived from olfactory mucosa. Methods : The hOECs were cultured and seeded separately onto the fibrin scaffolds as experimental group and the glass slides modified

4、with poly Jl lysine (PLL) as control group. After cultured 14 days, the morph of the hOECs was observed by sca nning electr on microscopy. To investigate the effects of fibrin scaffold on the myelin associated protei ns expressi on, the hOECs wereimmuno fluoresce nee stai ned with an tibodies aga in

5、st 2 ；3 cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase(CNPase) and myelin basic protein(MBP). The relative contents of CNPase and MBP were detected by Western blott ing. Results : The hOECs growthed on the fibrin scaffold showed ribbon like and arranged in alignment. Some hOECs had migrated in to the scaffol

6、ds. The results of immuno fluoresce nee stai ning and Western blott ing in dicated that the expressi ons of CNPase and MBP of hOECs grew on the fibri n scaffold were higher than that in the control group. Conclusion :The fibr in scaffold possesses a good biocompatibility with hOECs and could promote

7、 expressi ons of CNPase and MBP in the hOECs seeded in the scaffold. The tissue engin eeri ng composed of hOECs and fibrin could be used for implantation to repair the injured spinal cord.Key words human olfactory ensheathing cells(hOECs); tissue engineering scaffold; fibrin/fibrinogen; 2 ：3 cyclic

8、nucleotide 3 phosphodiesterase(CNPase); myelin basic protei n( MBP)现有研究资料表明，嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells , OECs) 移植修复脊髓损伤可促进实验动物的神经再生和改善后肢运动功能:1,2。临床试验结果亦显示OECs移植治疗脊髓损伤具有良好的应 用前景3-6 。成人鼻黏膜OECs因取材方便，可用于自体移植，对 其生物学特性及与支架材料的生物相容性进行研究具有更重要的实 用价值7。我们在前期的研究中发现，大鼠鼻腔嗅黏膜 OECs在纤维蛋白支架上生长良好8。但是，成人嗅黏膜 OECs与纤

9、维蛋 白的生物相容性如何，尤其是纤维蛋白支架对人嗅鞘细胞( humanolfactory en sheathi ng cells, hOECs )髓鞘形成相关蛋白的表达有何影响，仍不清楚。本研究将体外培养的成人嗅黏膜 OECs种植于纤维蛋白(fibrin, Fb)支架，用多聚赖氨酸修饰的玻片作为对照底物，观 察纤维蛋白支架对hOECs的形态及其2,3环核苷3磷酸二酯酶(2；3 cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase ，CNPase )和髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein ， MBP)表达水平的影响，以探讨 hOECs/纤 维蛋白支架移植入

10、脊髓损伤部位对再生神经纤维髓鞘形成的影响， 为 进一步评价hOECs/纤维蛋白支架移植修复脊髓损伤的可行性提供实 验研究资料。1材料和方法1.1嗅黏膜的活体取材和细胞培养嗅黏膜取自健康男性自愿者，42岁。消毒面部皮肤和鼻腔，鼻黏膜局部麻醉，在无菌条件下用鼻窦内窥镜自一侧上鼻甲钳夹 0.5 cm X0.5 cm嗅黏膜。嗅黏膜取出后用 DMEM/F12 （v/v=1 ：，pH=7.3 ） 培养基（Gibco公司）漂洗3次去除血迹后移至0.25%胰酶中，用眼科 剪充分剪碎并用吸管吹打，制成嗅黏膜混合细胞悬液，用含 10 %胎牛血清培养基终止消化，离心清洗去除胰酶。用含 10 %胎牛血清的培养基将细胞

11、浓度调至 1 X06/ml接种于无包被的玻璃培养瓶，置CO2培养箱内（37 C，5% CO2）培养。每3天换液一次，每天观 察细胞的生长情况，数码相机照相。当细胞铺满瓶底时进行消化、传 代。将第4代细胞接种于铺有圆盖片的24孔培养板，体外培养48 h 后用于免疫荧光染色。1.2体外培养嗅鞘细胞的免疫荧光染色鉴定接种于铺有圆盖片的24孔培养板的细胞在弃去培养液后用 PBS漂洗，4%低聚甲醛固定24 h。用嗅鞘细胞标志蛋白的抗体对培养细 胞进行间接免疫荧光（Cy3 ）染色。操作步骤如下：细胞经 0.25% TritonX100 37 C孵育 1 h ; 3%BSA 37 C封闭 1 h ;兔抗 N

12、GFRp75（Santa Cruz 公司）、小鼠抗 S100 （ Sigma 公司）和 GFAP（ Antibody Diagnostica公司）抗体4 C孵育过夜，37 C孵育2 h ; PBS漂洗后 用抗兔或抗鼠IgG Cy3(Sigma公司)37 C孵育1 h;用Hoechst33342复染细胞核显示全部细胞，以便分析嗅鞘细胞在培养细胞中所占的比 例。PBS漂洗后中性甘油封片，于Leica荧光显微镜下观察。1.3纤维蛋白支架及对照底物的制备实验分为支架组和对照组。支架及对照底物制备步骤如下：纤维 蛋白支架：将纤维蛋白原(fibrinogen, Fg )溶解于无血清DMEM/F12(v/v

13、=1 1 , pH=7.2 )混合培养基中，加入等体积新鲜鼠血浆，Fg的 终浓度为50 mg/ml。对照底物：将多聚赖氨酸(polyLlysine, PLL ) 溶解于无血清 DMEM/F12 (v/v=1 1，pH=7.3 )混合培养基，其终浓 度为0.2 mg/ml。按上述方法分别制备Fg和PLL溶液，均匀涂抹于 6孔培养板中和预先放有无菌圆玻片的 24孔培养板中。将上述培养板置37C培养箱，Fg溶胶自然凝固为凝胶状纤维蛋白支架，PLL溶 液干燥后即为对照底物。1.4 Fb支架及PLL底物上hOECs的培养及形态观察1.4.1hOECs的接种 取体外培养第4代的hOECs，以1 X105/

14、ml 的密度分别均匀接种于上述铺有 Fb支架及PLL的6孔和24孔(铺有 圆盖片)培养板中，置培养箱中用含 10 %胎牛血清的 DMEM/F12(v/v=1:1 ， pH=7.3 )培养基培养。以后每隔23天半量换液，并显 微镜下观察。1.4.2hOECs的扫描电子显微镜观察上述培养于Fb支架及PLL 上的嗅鞘细胞用2%戊二醛PBS固定液4C固定2 h; 4C PBS缓冲 液洗涤2次；1%锇酸PBS后固定液4 C固定2 h ;PBS缓冲液4 C 洗涤两次；30%70%乙醇（70%乙醇含3%醋酸双氧铀）4C逐级脱 水，每次10 min,醋酸异戊酯置换、二氧化碳临界点干燥，喷镀碳和 金膜后用扫描电

15、镜（Hitachi X650）观察细胞的表面结构。1.5 CNPase和MBP免疫荧光染色和免疫印迹测定1.5.1免疫荧光染色接种于24孔培养板内Fb支架及PLL上的 hOECs培养7天后，用4%低聚甲醛固定，PBS漂洗后3% BSA 37 C 封闭1 h ;分别用鼠抗CNPase和兔抗MBP抗体（Chemicon ） 4C 孵育过夜，37 C孵育2 h; PBS漂洗后用羊抗鼠lgGCy3或羊抗兔 lgGFITC（Sigma公司）37 C孵育1 h;进行间接免疫荧光（Cy3 ）染色。1.5.2细胞内蛋白的提取 接种于6孔培养板内Fb支架及PLL上的 hOECs培养7天后，倒去培养液，用预冷TB

16、S洗涤3次除去残余培 养液，迅速收集细胞于Enpdoff管中，加入300 RIPA （Santa Cruz ） 裂解液及 PMSF, Protease inhibitor cocktail, sodium orthovanadate 各3山 置冰浴中裂解45 min后，4 C 10 000为 离心10 min，取 上清，测定蛋白浓度后与等量 2X上样缓冲液混匀后煮沸3 min。1.5.3蛋白电泳及免疫印迹 按实验室常规方法配制12%聚丙烯酰 胺凝胶，根据上述样品的蛋白浓度，按各泳道蛋白总量相等的原则计 算样品体积后上样、电泳、转膜，分别用鼠抗 CNPase和兔抗MBP抗体及山羊抗鼠或抗兔IgG

17、HRP（华美生物工程公司）孵育，ECLplus 作为发光剂（Amersham Biosciences公司产品），于分子成像系统（Typhoon 9400 ）上扫描。以GAPDH作为内参，测定各组 CNPase 或MBP蛋白条带与GAPDH蛋白条带的光密度并计算其比值，进行统计学处理。2结果2.1嗅鞘细胞生长特性及其标志蛋白的表达嗅黏膜细胞接种于玻璃培养瓶后贴壁良好。体外培养 48 h后，可见贴壁的细胞成分有扁平细胞、球形细胞和梭形细胞。经3次传代培 养后，大多细胞为梭形的嗅鞘细胞，相邻细胞突起的延伸方向较为一 致。免疫荧光染色显示大多细胞表达 NGFRp75,S_100，GFAP三种 嗅鞘细胞

18、标志蛋白（图1 ）。2.2hOECs在Fb支架及PLL上的生长特性hOECs接种于支架后24 h内全部贴壁并逐渐生长出突起。48 h后 可见细胞分裂相。体外培养7d后细胞铺满支架并向支架内部生长。 扫描电子显微镜观察发现hOECs呈扁条带状，细胞表面可见微绒毛。 相邻细胞的排列方向较一致。部分细胞已向支架内迁移。与支架组比 较，PLL组的hOECs分布较稀疏，细胞排列方向性不明显（图 2）。2.3Fb支架对hOECs表达CNPase和MBP的影响免疫荧光染色结果显示，Fb支架上hOECs的CNPase和MBP 荧光染色强度大于PLL组细胞的荧光强度（图3）。免疫印迹结果显 示，Fb支架组CNP

19、ase和MBP蛋白条带的光密度大于对照组蛋白 条带的光密度（图4）。对两组CNPase和MBP与内参（GAPDH） 条带的光密度比值进行配对t检验，差异有统计学意义（P0.05），表 明Fb支架可促进hOECs表达CNPase和MBP两种髓鞘相关蛋白。3讨论嗅鞘细胞(OECs )是位于嗅球和鼻腔嗅黏膜中的一种独特的神经 胶质细胞，兼有星形胶质细胞和雪旺氏细胞的生物学特性 9oOECs 移植入脊髓损伤部位后，即可引导神经轴突再生又可形成髓鞘:10-13 。作为一种较为理想的种子细胞，OECs可用于构建组织工 程支架移植修复脊髓损伤。但是 OECs在支架内的生物学特性受到 支架材料的影响，因此材料

20、的选择对于构建生物相容性好、可供移植 的组织工程支架至关重要。目前，应用于神经再生研究的支架材料较 多的是人工合成的高分子聚合物。这一类材料构建的支架虽有较高的 机械强度，但因其生物相容性不如人体自身细胞外基质 ，实际应用于体内移植受到一定限制。选用天然材料或人体自身来源的材料构建组 织工程支架将是今后的发展趋势。我们在前期的研究中用纤维蛋白原 溶液与新鲜血浆混合成功地构建了纤维蛋白支架并研究了大鼠 OECs在纤维蛋白支架上的生长特性，结果表明大鼠OECs与纤维蛋 白支架具有良好的生物相容性。在此基础上，本研究将人嗅鞘细胞(hOECs )种植于纤维蛋白支架，观察支架对髓鞘相关蛋白的表达 有何影

21、响，发现纤维蛋白支架上生长的 hOECs高表达CNPase和 MBP两种髓鞘相关蛋白。扫描电镜观察发现，支架上hOECs呈扁条 带状，细胞表面可见微绒毛。相邻 hOECs的排列方向较一致。部分 细胞已向支架内迁移。由此说明，hOECs与纤维蛋白支架具有良好 的生物相容性，该支架可诱导 hOECs向髓鞘形成类胶质细胞分化。 纤维蛋白的这一生物学特点对于构建组织工程支架用于移植修复脊 髓损伤，促进损伤部位再生神经纤维的髓鞘形成具有重要的生物学意义。已有学者用Fb构建生长因子缓释支架移植修复脊髓损伤，可促 进神经再生14。若将hOECs种植于纤维蛋白胶内，构建一种含 种子细胞的组织工程支架移植修复脊

22、髓损伤， 不仅可填补组织缺损的空隙，为神经再生提供细胞外基质，同时可保持支架内 hOECs的髓鞘形成特性，为再生神经纤维的髓鞘化提供条件。 本研究中作为种子细胞的hOECs可取自于自体鼻黏膜，细胞的分离和体外培养方法稳 定可靠,细胞经过多次差时贴壁，传代培养可去除成纤维细胞，将 hOECs的纯度提高到90%以上7。支架的材料可来源于人体自体 血液，构建支架的程序操作简单可行15 本研究为hOECs/纤维 蛋白组织工程支架自体移植修复脊髓损伤提供了可行性研究资料。【参考文献】1 RamonCueto A, Cordero Ml, Santos Benito FF, et al.Fun cti o

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