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1、生物基因工程实验讲义实验十三 PCR扩增制备目的基因和电泳检测I PCR扩增制备目的基因一、目的要求学会PCR技术的基本操作。二、基本原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。1985年美国的Mullis等人发明了PCR技术，在体外利用模板DNA 、特定的寡聚核苷酸引物和DNA聚合酶，通过DNA变性、复性和延伸过程合成一条互补的DNA链。反复重复这一过程，模板DNA就可得到大量扩增。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次

2、循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93-94）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，以目的基因为模板从53方向延伸，合成DNA的新互补链。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。但正因为PCR强大的扩增能力，PCR所用离心管、吸头和溶液等都要严格灭菌，以防反

3、应体系被外源DNA污染。三、器材微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，恒温水浴。5U/l Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（10，含MgCl2），dNTP，引物，模板DNA，无菌双蒸水。 四、操作步骤（1）在0.2ml PCR 微量离心管中配制50l反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算） 无菌双蒸水 37.75 l 10PCR buffer（含MgCl2） 5l dNTP Mixture (各2.5mM) 4l（每种dNTP终浓度0.2mM） 10mol/L Primer1

4、 1l（12.525pmoles） 10mol/L primer2 1l（12.525pmoles） 模板DNA 1l（110-3pmoles） 5U/l Taq酶 0.25l 总体积 50l（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序： 94 5min 94 1min 52 1min 72 1min 30 cycles 72 5min（3）PCR结束后，取4l产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。（4）清理桌面。II DNA电泳检测一、目的要求学会DNA琼脂糖凝胶电泳的基本操作。二、基本原理DNA带负电荷，在电场作用下可以向阳极移动，相对分子质量越小，迁移越快，相对分子质量越大，迁移越慢。DNA的构

5、象对迁移速度也有一定的影响，向阳极迁移的速度超螺旋大于线状，线状大于开环。电压在一定的范围，线状DNA片段的迁移速率与所加的电压成正比。为了使分辨效果更好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm，因此，我们可以利用这些特性通过琼脂糖凝胶电泳，区别不同相对分子质量的DNA片段和质粒。三、器材电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。TBE电泳缓冲液（50），Goldview，电泳级琼脂糖粉，加样缓冲液（10），DNA分子量标准（DL2000: 2000，1000，7

6、50，500，250，100 bp）。 四、操作步骤（1）称取0.2g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入30ml TBE电泳缓冲液(1)，放入微波炉中烧开（1min）。（2）注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波加热。（3）戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手。加入2l Goldview.（4）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。（5）在水平电泳槽中加满1TBE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至140V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。（6）

7、待胶完全凝固后，小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。（7）剪1片塑料片，点5l蒸馏水、1l 10加样缓冲液，再加入4l上述PCR产物制成10l DNA样品。（8）在凝胶上选择相邻的加样孔。用10l的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入3l DNA分子量标准物DL2000）。（9）打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动，电泳将进行约30min。（10）当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。（11）清理垃圾。含有Goldview的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理

8、，以免污染环境。五、实验报告1结果记录实验过程及电泳检测结果。2思考题今天PCR扩增实验的特异性好不好？如果不好请分析原因。实验十四 质粒DNA的小量制备一、目的要求学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。二、基本原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH 12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH 4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA

9、一起沉淀下去。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pET28a质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状

10、质粒DNA（covalently closed circular DNA,简称CCCDNA），开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂（open circular DNA ,简称OCDNA），线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linear DNA,简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。三、器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅

11、拌机。四、试剂溶液 I50 mmol/L mol葡萄糖25 mmol/L TrisHCl (pH8.0)10 mmol/L EDTA (pH8.0)溶液 II0.4 mol/L NaOH2% (W/V) SDS溶液使用前按1：1混合溶液 III 5 mol/L KAc溶液 60 ml冰乙酸 11.5 ml水 28.5 mlpH4.8大肠杆菌，LB培养基1000ml，氨苄青霉素溶液，RNase A，无水乙醇，70%乙醇，TE buffer（10 mmol/L TrisHCl pH8.0, 1mmol/L EDTA pH8.0）。五、操作步骤（1）在超净工作台中取5ml LB（加入氨苄青霉素溶液，

12、使其终浓度为100g/ml），加入灭菌的试管中。（2）用含目的质粒的大肠杆菌接种无菌LB培养基（含100g/ml氨苄青霉素），37C摇床培养12h。（3）取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，10000rpm离心1min，弃上清液，留沉淀备用。（4）在沉淀中加入100 l 溶液I，剧烈振荡。（5）加入200 l 溶液II，混匀，盖紧管口，迅速颠倒离心管数次，以混匀内容物直到内容物变清澈为止，不要剧烈振荡，将离心管置于冰上。（6）加入150 l 溶液III，混匀，盖紧管口，迅速温和地颠倒离心管几次，使溶液III混合均匀，将离心管置于冰上3-5分钟。（7）12000rpm离心5min，小心吸取上

13、清液于另一个干净的1.5ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，立即混匀，室温下静置5min。（8）10000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500 l 70% 乙醇，立即混匀。10000rpm离心10 min，小心弃掉上清液。（9）再加入500ml 70% 乙醇，立即混匀。10000rpm离心10 min，小心弃掉上清液。（10）离心管倒置于37C空气干燥。（11）加入40l无菌双蒸水溶解，保存于-20备用。（12）电泳检测。六、实验报告1结果记录所提取的质粒的电泳检测结果。2思考题质粒提取中溶液I、溶液II和溶液III的作用分别是什么？实验十五 PCR产物与载体的酶切与凝胶回收纯

14、化一、目的要求工具酶的使用和DNA凝胶回收二、基本原理工具酶是基因重组技术不可缺少的工具。主要有限制性内切酶、连接酶、核酸聚合酶、逆转录酶、核酸酶等。DNA限制性内切酶有三种类型：型、型和III型。型能严格识别核酸序列，并在识别区内特定的核苷酸处切开DNA双链。故通常所指都是型限制性DNA内切酶。识别分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋转对称。切口分开端和粘端，产生3OH和5P末端。内切酶品种多，使用时应注意温度、缓冲液用量、酶量（一般1g DNA/2-5单位酶）等反应条件。三、器材微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，恒温水浴。四、试剂限制性内切酶EcoRI，XhoI，无菌双蒸水五

15、、操作步骤平行做三管PCR 产物 10l10x H buffer 2 lEcoRI 1 lXhoI 1 l无菌双蒸水 6 l37C水浴平行做两管pFLAG-CTS 5 l 10x H buffer 2 lEcoRI 1lSalI 1 l 无菌双蒸水 11 l37C水浴加入加样缓冲液（10），电泳后，割胶回收。电泳切胶注意事项：1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源DNA污染。2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。3. 隔着有机玻璃（防护眼睛受到紫外线伤害）观察凝胶并完成切胶。从凝胶中回收纯化DNA的具体操

16、作步骤参照凝胶产物纯化试剂盒说明书。六、实验报告1结果记录酶切产物的电泳检测结果。2思考题 对核酸进行限制性酶切时应注意什么？核酸回收时应该注意什么？实验十六 目的基因片段与载体连接一、目的要求学会DNA片段的体外连接技术。二、基本原理 在Mg2+和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。 三、器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。四、试剂pFLAG-CTS载体，目的基因插入片段，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌双蒸水五、操作步骤（1）事先将干式恒温

17、仪（或冰盒里的水）温度设定在1416C。（2）取一个灭菌的1.5ml微量离心管，加入：酶切凝胶回收PCR 产物 7.5 l酶切回收的pFLAG-CTS载体 1l 连接酶缓冲液 1lT4 DNA连接酶（350U/l） 0.5l 总量 10l 体系 （3）上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14C水中保温过夜。（4）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4C冰箱备用。六、实验报告思考题 DNA连接应注意什么？ 实验十七 大肠杆菌感受态细胞的制备I 大肠杆菌感受态细胞的制备一、目的要求学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。二、基本原理转化系指将外源DNA导入受体细胞并使其获得新的遗传性状的

18、现象，转化子是指带有外源DNA并获得新遗传性状的受体细胞。转化实验技术是当前基因工程、分子生物学研究领域中的一项重要实验技术。实现转化重要条件之一，就是必须使受体细胞处于感受态，即受体细胞处于最容易接受外源DNA的一种生理状态。通常，制备大肠杆菌感受态细胞方法，是利用CaCl2等处理大肠杆菌，使其细胞膜的通透性发生改变，从而使带有外源DNA的载体容易进入受体细胞，通过复制与表达，使受体细胞获得新的遗传性状。细菌在0C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。三、器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量

19、离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。四、试剂E. coli Top10，LB培养基（不含抗菌素！），0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌双蒸水五、操作步骤（1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2ml LB培养基。（2）从平板上挑一个E. coli Top10单菌落接入含2ml LB培养基的试管中，37摇床培养过夜。（3）取0.5ml上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37下250r/min摇床培养34 h，测定OD590为0.40.5。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。（4）将菌液分装到1

20、.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4，5000rpm离心10min。（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即混匀，插入冰中放置30min。（6）4，5000rpm离心10min，弃上清液后，用1mL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬，插入冰中放置30min。（7）4，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200L 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬，超净工作台中按每管100L分装到1.5mL离心管中，插入冰中放置2小时以上，即可直接用作转化实验。（8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦

21、干桌面，写实验报告。II 细菌转化一、目的要求学会质粒DNA转化感受态大肠杆菌的技术。二、基本原理 质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42C短时间的热击处理，促进吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。三、器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。四、试剂LB液体培养基（不加抗菌素），LB+Amp固体培养基（加氨苄青霉素）。五、操作步骤 （1）事先将恒温水浴的温度调

22、到42。（2）取一管（100L）冰浴的感受态菌，加入5L连接好的质粒混合液，轻轻震荡后放置冰上30min。（3）轻轻摇匀后插入42水浴中90 s进行热休克（切勿晃动），然后迅速放回冰中，静置5min。（4）在超净工作台中向上述各管中分别加入500L LB培养基轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37震荡1h。（5）在超净工作台中取上述转化混合液离心后，用移液器把大部分上清液取出，保留200L，用移液器反复吹打悬浮菌体细胞，滴到含氨苄青霉素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。（6）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37恒温培养箱中3060min直到表面的液体都渗透到培养基里后

23、，再倒置过来放入37恒温培养箱过夜。（7）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。（8）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。六、实验报告1结果记录转化结果。2思考题 转化时为什么要设置阴性对照？如阴性对照中长出菌，请分析原因。实验十八 工程菌的诱导和酶活性检测一、目的要求学习基因工程菌的诱导方法以及用淀粉平板对淀粉酶活的检测方法二、基本原理淀粉酶基因克隆入pFLAG-CTS表达载体，与载体中的大肠杆菌OmpA信号肽序列融合，置于tac启动子控制之下。tac启动子是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，因此可受IPTG的诱导。

24、当pFLAG-CTS表达载体进入E. coli Top10细胞后，由于宿主细胞的lac Iq基因表达产生的阻制物抑制RNA聚合酶基因的表达，在载体上的目的基因就无法启动。当存在IPTG诱导物后，使阻制物失去阻制作用，RNA聚合酶基因得以表达，从而使目的基因得以表达。三、器材平皿，离心机，微量移液取样器，移液器吸头四、试剂用无菌双蒸水配置100 mM IPTG（分子量238.3），滤器过滤除菌，分装成1 ml小份贮存于-20。LB液体培养基，氨苄青霉素（100mg/ml），无菌圆形滤纸片。淀粉平板：在LB固体培养基配方基础上添加1%可溶性淀粉，115灭菌30分钟。将培养基加热融化后冷却到40-5

25、0时加入氨苄青霉素和IPTG，摇匀后倒平板。卢戈氏碘液：碘片1 g，碘化钾2 g，蒸馏水300 ml。先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即可。五、操作步骤（1）挑取少量pFLAG-Amy/Top10菌体接种于含Amp（终浓度100 g/ml）的5ml LB液体培养基中，于37培养过夜；以相同条件接种pFLAG-CTS/Top10为对照。（2）制备淀粉平板，待凝固后在平板表面放置2张无菌圆形滤纸片。（3）分别取上述2种一级培养物各10 l分别滴在淀粉平板表面的不同滤纸片上，将平板静置5分钟后置37温箱培养过夜（正置培养，不要倒置）。（4）观察滤纸片上菌苔生

26、长情况。将平板打开盖子，在固体培养基表面覆以卢戈氏碘液。六、实验报告1结果记录大肠杆菌转化子的酶活检测结果。2思考题 分析大肠杆菌转化子的酶活检测结果说明了什么。实验十三-十八（基因工程大实验）背景知识介绍本实验操作的淀粉酶基因是Bacillus licheniformis DSM 13的-淀粉酶基因。该基因的全序列已有报道，如下：本大实验的整体思路是：从Bacillus licheniformis DSM 13基因组中PCR扩增得到该淀粉酶基因。将该淀粉酶基因克隆入pFLAG-CTS表达载体的EcoRI/ SalI位点，与载体中的大肠杆菌OmpA信号肽序列融合（大肠杆菌外膜蛋白OmpA的信号

27、肽可帮助重组酶分泌至大肠杆菌受体菌周质空间和培养基中），置于tac启动子控制下，构成重组质粒pFLAG-Amy。将重组质粒pFLAG-Amy转化入E. coli Top10后淀粉酶基因可在IPTG诱导下过量表达并分泌到胞外，这可以通过淀粉平板定性检测。PCR扩增得到淀粉酶基因的引物如下：pFlAmyforward（引入EcoRI site）:(5-CTg TgCgAA TTC gCA AAT CTT AAT gggACgCTgATg C-3) pFlAmyreverse（引入XhoI site）:(5-gCACAg CTC gAg TCT TTg AAC ATA AAT TgA AAC CgA

28、 CCC-3)将PCR产物用EcoRI+ XhoI双酶切后连入pFLAG-CTS表达载体的EcoRI/ SalI位点，原因在于XhoI 和SalI是同尾酶。EcoRI、XhoI和SalI的识别序列和切口如下：EnzymeSourceRecognition sequenceCutEcoRIEscherichia coli RY135 GAATTC3 CTTAAG5 -G AATTC- 33 -CTTAA G- 5XhoIXanthomonas holcicola5 CTCGAG3 GAGCTC5 -C TCGAG- 33 -GAGCT C- 5SalIStreptomyces albus5 GTCGAC3 CAGCTG5 -G TCGAC- 33 -CAGCT G- 5但要注意的是，连接而成的重组质粒用XhoI和SalI均不能切开（想想为什么？）。pFLAG-CTS表达载体的图谱如下：