西地那非同系物逆转人乳腺癌MCF7ADR细胞的耐药性研究.docx

1、西地那非同系物逆转人乳腺癌MCF7ADR细胞的耐药性研究论著(基础研究西地那非同系物逆转人乳腺癌MCF-7/AD细胞的耐药性研究季恒,葛如意,王德全,梅文杰,黄海波,周俊立,郑士杰,石永超,汪保国,陈思东摘要目的肿瘤多药耐药(multidrug resistance ,MD是肿瘤化疗失败和患者死亡的一个主要原因,研发无毒的MD逆转剂是治愈肿瘤的一项探索性研究。文中探讨2种西地那非同系物对人乳腺癌MCF-7/AD细胞耐药性的逆转作用。方法采用MTT 法检测西地那非、西地那非同系物、多柔比星以及西地那非同系物与多柔比星联合作用对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/AD和敏感株MCF-7的抑制率及IC 50

2、值;运用流式细胞术观察分别经西地那非同系物处理前后,人乳腺癌MCF-7/AD细胞内hodamine 123浓度的改变情况,并分析该2种同系物对乳腺癌细胞P-gp 蛋白外排功能的影响。结果MTT 结果显示10mol /L 的2种西地那非同系物对MCF-7/AD细胞耐药性的逆转倍数分别是636和558;20mol /L 的2种西地那非同系物对MCF-7/AD细胞耐药性的逆转倍数分别是1183和1347;流式细胞术结果显示经10、20mol /L 的西地那非同系物处理后的MCF-7/AD细胞内hodamine 123浓度明显增强。结论一定浓度的西地那非同系物可抑制乳腺癌MCF-7/AD细胞P-gp

3、蛋的外排功能,并显著逆转其对多柔比星的耐药作用。关键词XDNF1-0425;XDNF8-0113;多药耐药;逆转;乳腺癌细胞中图分类号9799文献标志码A 文章编号1008-8199(201403-0245-05基金项目:广州市国际区域科技合作项目(2011J5200017作者单位:510006广州,广东药学院研究生院季恒(医学硕士研究生;510310广州,广东药学院公共卫生学院(葛如意、王德全、梅文杰、黄海波、周俊立、郑士杰、石永超、汪保国、陈思东通讯作者:汪保国,E mail :gdwangbaoguo163com Sildenafil homologues reverse the dru

4、g resistance of human breast cancer cell line MCF-7/ADJI Heng 1,GE u-yi 2,WANG De-quan 2,MEI Wen-jie 2,HUANG Hai-bo 2,ZHOU Jun-li 2,ZHENG Shi-jie 2,SHI Yong-chao 2,WANG Bao-guo 2,CHEN Si-dong 2(1Guangdong Pharmaceutical University ,graduate school ,Guangzhou 510006,Guangdong ,China ;2GuangdongPharma

5、ceutical University ,School of Public Health ,Guangzhou 510310,Guangdong ,China Abstract Objective Multidrug resistance (MDof carcinoma is an important cause of chemotherapy failure and mortality in cancer patientsThe aim of this study was to explore the reversal effect of XDNF1-0425and XDNF8-0113on

6、 Doxorubicin (DOX resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADin vitroMethods Using MTT assay ,we determined the inhibitory effect ofsildenafil ,XDNF1-0425,XDNF8-0113,DOX and DOX +sildenafil homologues on the growth of human breast cancer cell lines MCF-7and MCF-7/AD,and figured out the inhi

7、bitive concentration 50(IC 50We used flow cytometry to detect the concentration of rhoda-mine123in the MCF-7/ADcells treated with XDNF1-0425or XDNF8-0113and analyzed its effect on P-gp-mediated drug effluxesults The sensitivity of MCF-7/ADto DOX was significantly increased by the two sildenafil homo

8、logues XDNF1-0425andXDNF1-0113in a dose-dependent manner (P 005XDNF1-0425and XDNF1-0113reversed the drug resistance of MCF-7/ADby 636and 558times at 10mol /L and by 1183and 1347times at 20mol /L ,respectivelyFlow cytometry showed significantly increased concentrations of rhodamine123in the MCF-7/ADc

9、ells after treated with the two sildenafil homologues at 10or 20mol /LConclusion Sildenafil homologues at a certain concentration can inhibit P-gp-mediated drug efflux of the human breast cancer cell lineMCF-7/ADand effectively reverse its resistance to DoxorubicinKey words XDNF1-0425;XDNF8-0113;Mut

10、idrug resistance ;everse ;Breast cancer引言多药耐药(multidrug resistance ,MD是指肿瘤细胞长期接触某一化疗物后可产生对此种化疗药物耐药性,而且可对其他结构和作用机制不同的多种化疗药物产生交叉耐药性。多柔比星(Doxorubicin 是乳腺癌化疗的常用药物,乳腺癌细胞的对多柔比星产生耐药是多柔比星化疗失败的主要原因1,也是影响临床肿瘤患者预后的重要因素2。乳腺癌是排名第一的女性常见恶性肿瘤,寻找克服乳腺癌MD的药物或方法成为当前肿瘤研究的热点3。目前研究发现MD的有效抑制剂有维拉帕米、环孢素A、三苯氧胺、类固醇激素46等,但这些耐药逆

11、转剂干扰传统的抗癌药物药代动力学,且由于可引起严重的毒副作用等,至今都未取得预期的临床效果,因此在临床上被限制使用。寻找低毒高效且与合用的抗肿瘤药物无药动学交互作用的抑制剂,以提高药物的利用度,避免和降低药物的不良反应在指导临床抗肿瘤个体化治疗方面具有重要意义,同时也是当前肿瘤耐药性研究中的重要发展方向。西地那非(Sildenafil,又译昔多芬,是一种研发治疗心血管疾病药物时意外发现的治疗男性勃起功能障碍药物。已有研究发现5型磷酸二酯酶抑制剂西地那非7和伐地那非8能逆转P-gp蛋白介导的MD。同时也有研究发现西地那非和伐地那非可逆转MD相关蛋白7(MP7介导的紫杉醇耐药9。本研究所用药物是西

12、地那非的同系物,由本实验室指导广东药学院药科学院实验室合成的新型化合物,拥有独立的知识产权。本研究旨在通过观察药物处理后MCF-7/AD和MCF-7细胞株的生长抑制率、hodamine123浓度,探讨西地那非同系物体外实验的安全性极其逆转乳腺癌MCF-7/AD细胞耐药性的机制。1材料与方法11细胞株实验所用MCF-7和MCF-7/AD细胞株由中山大学附属肿瘤医院惠赠;其中MCF-7/ AD细胞株是通过浓度递增的多柔比星反复间歇诱导获得,对多柔比星耐药,而MCF-7细胞则为敏感细胞株。12药物和器材本研究所用药物是由广东药学院药科学院实验室合成的新型化合物,化学物结构式见图1(自编号XDNF1-

13、0425和XDNF8-0113,其电喷雾质谱(ESI-Ms分别为m/z4123(M+H+和m/z3313(M+H+;西地那非单体由圣约翰大学陈哲生教授惠赠;多柔比星、MTT、hodam-inel23均购于美国Sigma公司,DMEM培养基购于美国Hyclone公司,倒置显微镜为日本Nikon公司产品,流式细胞仪为美国BD公司产品。13细胞培养人乳腺癌细胞MCF-7和MCF-7/ AD于含10%胎牛血清和青霉素(100U/mL、链霉素(100U/mL的DMEM培养液中常规培养(37、5%CO2。实验前在无药培养基中培养2周。细胞隔日换1次培养液,每隔3、4天传代1次 。a:XDNF1-0425;

14、b:XDNF8-0113;c:西地那非图1XDNF1-0425、XDNF8-0113和西地那非结构图Figure1Structural formulas of XDNF1-0425,XDNF8-0113and sildenafil14MTT法检测细胞毒性实验141MTT法10测定2种西地那非同系物体外实验的安全浓度取对数生长期MCF-7和MCF-7/ AD细胞进行种板(8000细胞/孔,CO2的培养箱培养24h后分别加入不同浓度的XDNF1-0425和XDNF8-0113(1、10、100、1000mol/L,不加药物的为阴性对照组,只加培养基的为调零组,每组设3个复孔;继续培养68h后加入1

15、0L MTT(5mg/mL,培养4h后酶标仪(波长570nm检测吸光值(A,并绘制药物浓度与细胞生存率曲线图。细胞生存率=A加药组/A对照组100%142MTT法测定2种西地那非同系物对MCF-7/ AD耐药的逆转作用采用上述方法将准备好的MCF-7和MCF-7/AD细胞分组种板,每组设3个复孔。24h后加药,共分5组:只加培养基的调零组;不加药物只加细胞的阴性对照组;多柔比星组:按浓度梯度分别加入多柔比星(001、003、01、03、10、30、100、300mol/L,每孔10L;多柔比星+药物组:XDNF1-0425和XDNF8-0113分别以无毒剂量(25、50、100、200mol/L与多柔比星共同加入;多柔比星+西地那非组:不同浓度的西地那非(25、50、100、200mol/L与多柔比星共同加入。CO2的培养箱继续培养68h后常规MTT比色法测定和记录各孔A值,并计算抑制率、半抑制率(IC50以及逆转倍数。IC50通过线性回归分析计算,细胞抑制率和逆转倍数公式计算如下:细胞抑制率(%=(1实验孔A值/对照孔A值100%逆转倍数=耐药细胞IC50/药物干预下IC50 15细胞内hodamine123累积实验取对数生长期MCF-7和MCF-7/AD