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1、发酵复习仅第二章没看发酵工程复习题第2章 发酵工业菌种一、工业常用微生物的种类1.1工业化菌种的特性有些微生物能在厌氧条件下生长有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的生长有些微生物能进行复杂的代谢有些微生物能利用较复杂的化合物有些微生物能在极端的环境下生长1.2工业化菌种的要求能够利用廉价的原料，大量高效的合成产物；有关合成的产物尽可能地简单，菌种改造的可操作性强遗传性能相对稳定不易感染其他微生物或噬菌体产生菌及其代谢产物的毒性必须考虑生产特性要符合工艺要求1.3细菌（bacteria）1.3.1细菌的概念：细菌是一类形状细短，结构简单，多以二分裂方式进行繁殖的原核生物。是自然界分布

2、最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。1.3.2细菌的分类根据细菌的形状分类，可分为三类：球菌、杆菌和螺形菌；按细菌的生活方式分裂，分类两大类：自养菌和异养菌，其中异养菌包括腐生菌和寄生菌；按细菌对氧气的需求分类：分为需氧型和厌氧型细菌。1.3.3细菌的种类醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌乳酸杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌1.4酵母菌（yeast）1.4.1酵母的概念：酵母菌为单细胞真核生物（unicellular eukaryote），在自然界普遍存在，主要分布于含糖质较多的酸性环境，在水果、蔬菜、花蜜以及子午叶子和果园土壤中分布广泛。目前已知有1000

3、多种酵母。1.42酵母的分类：根据酵母菌产生孢子（子囊孢子和担孢子）的能力，可将酵母分成三类：子囊菌、担子菌以及不完全真菌，即不形成孢子但主要通过出芽生殖来繁殖或者叫“假酵母”1.4.3酵母菌的生长过程：酵母菌大多为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖，酵母细胞体积长到一定程度开始发芽，芽长大的同时母细胞缩小，在母子细胞间形成隔膜，最后形成大小一样的母细胞，如果子芽不与母细胞脱离就形成了链状细胞，称为“假菌丝”（pseudomycelium）。1.4.4酵母菌的种类i酿酒酵母ii假丝酵母属iii毕赤酵母属、汉逊酵母属1.4.5工业应用的酵母菌：啤酒酵母（Saccharomyces cer

4、evisiae）假丝酵母（Candida）类酵母（Saccharomycodes）等用途：主要用于酿酒（Brewing）、制造面包、制造凝固点石油、生产脂肪酶（lipase)， 以及生产食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。1.5霉菌(mould)1.5.1概念：霉菌，是丝状真菌的俗称，意为“发霉的真菌”，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，即为霉菌。1.5.2 霉菌的分布、寄生方式、繁殖方式、类型：i霉菌在自然界分布广泛，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处，它喜欢偏酸性环境，大多数为好氧

5、性（aerobiotic），ii多为腐生，少为寄生。iii霉菌的繁殖能力很强，它以无性孢子和有性孢子进行繁殖，大多数以无性孢子繁殖为主。iiii根据菌丝中是否存在隔膜，可把霉菌菌丝分成两种类型：无隔膜菌丝和有隔膜菌丝。1.5.3霉菌的菌属i曲霉属ii青霉属iii根霉属iiii红曲霉属1.5.4工业上常用的霉菌：藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉、半知菌类的曲霉、青霉等；产品：酶制剂（enzyme preparation）抗生素（antibiotic）有机酸（organic acid）甾体激素（steroid hormone）等 1.6放线菌(Actinomycetes)1.6.1概

6、念：放线菌（Actinobacillus）是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。1.6.2分布：放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。1.6.3分类：放线菌只是形态上的分类，属于细菌界放线菌门。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。1.6.4繁殖方式: 放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌丝片段进行繁殖。后一种繁殖方式见于液体沉浸培养（submerged cultures）中。其生长方式是菌丝末端伸长和分支，彼此交错成网状结构，成为菌丝体。菌丝长度既受遗传性的控制，又与环境

7、相关。1.6.5放线菌菌属链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌经济价值：最大的经济价值在于能产生多种抗生素（antibiotics)，60%以上的抗生素是由放线菌产生的，如：链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等1.7担子菌（Basidomycetes）1.7.1概念及特点：所谓的担子菌，就是人们常说的菇类（mushroom)生物。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视，如多糖（polysaccharide）、抗癌（anticancer）药物的开发。担子菌最大特点是形成担子(basidium)、担孢子(basidiospore)。1.7.2研究进展：对香菇的抗癌作用机制进行了深入的研究

8、探索，发现香菇中的“1,2-葡萄糖苷酶”及糖类物质具有明显的抗癌作用。1.8 藻类1.8.1概念：藻类是原生生物界一类真核生物 (有些也为原核生物，如蓝藻门的藻类）。主要水生，无维管束，能进行光合作用。体型大小各异，小至长1微米的单细胞的鞭毛藻，大至长达60公尺的大型褐藻。1.8.2应用：i蛋白质：培养珊列藻，从蛋白质产率计算，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20-35倍。ii石油：通过藻类将CO2转变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占细胞干重的5%-50%，合成的油与重油相同，加工后可转变汽油、煤油和其他产品。iii单胞藻的农场：每年每公顷地培植的单胞藻按照5%干物质为碳水化合物（

9、石油）计算，可得60吨石油燃料。此项技术的应用，还可以减轻因工业生产而大量排放CO2造成的温室效应。iiii氢能：国外还有人从“藻类农场” 获取氢能的报道，利用大量培养藻类，其光合作用释放氢气获得氢能。2、常用菌种的分离筛选原则（一）菌种筛选的基本原则1菌种的来源i根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；ii从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 2菌种选择要求能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收； 生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；培养条件易于控制；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；菌种不易变异退化；对放大设备的适应性强；菌种不是病原菌，不

10、产生任何有害的生物活性物质和毒素。3分离思路： 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。4菌种分离与筛选的步骤：i定方案：首先查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性；ii采样：有针对性地采集样品；iii样品预处理与增殖：为提高分离效率，人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势；iiii分离：利用分离技术得到纯种；iiiii发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、

11、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等； 调查研究（包括资料查阅） 试验方案设计 含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微生物的可能性大？）样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可能性实现）菌种分离 发酵性能测定 具体步骤：4.2采样采样对象：以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取

12、离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。采样时要注意的问题：i气候、水分、空气ii来源要广iii结合产品的特点iiii标签：地点、时间、气候等4.3样品预处理与增殖4.3.1样品预处理目的：提高分离效率方法：i物理方法：热处理；膜过滤法；离心法ii化学方法iii诱饵法4.3.2增殖培养为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，

13、或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。4.4培养分离4.4.1为什么要建立科学和针对性不强的分离方法？从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。 到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢微生物相适应。因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方法是必要的。4.4.2培养分离中要解决的问题：“分离什么和从哪里分离出?

14、”i充分考虑所分离微生物的生产能力、生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性及遗传操作的难易程度等。ii选择适宜的培养分离方法和检测方法。4.4.3生态学方法用于培养分离思路罗列出所要分离的微生物类群；根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地： 将若干样本分成若干类型，如植物和植物各部，土壤(类型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵食品等；罗列出所要考察和测量的环境参数，如pH、盐分、水分、氧化还原电势及温度等；列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适

15、宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件；用标准方法作对照来评价生态学分离方法；根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。4.4.4纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法等。采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。4.5毒性试验微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。（二）自然界中细菌的分离1采样和采集方法1.1重要性：为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一

16、微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。1.2工具：样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。1.3采样的注意事项采样时应尽可能保持相对无菌；所采集的样本必须具有某种代表性；采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。1.4三种采样方法土样采集

17、方法森林、旱地、草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面515cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分即为根际土样。植物体采集方法在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净

18、的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。水样采集方法用于细菌检测的水样应收集于100ml干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。方法：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4下贮存。2土中细菌的富集培养与分离2.1重要性：分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。2.2目的细菌富集的一些

19、基本方法i定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养；ii当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑；iii不能提供任何有助于筛选产生菌的信息时，只能通过随机分离的办法；iiii除此之外，运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。富集的作用：富集可以促进抗性的产生并维持下来。2.3富集后分离（三种分离方式）土样中细菌的分离：适度稀释后，取0.1ml涂布已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀

20、释后涂布平板。水中细菌的分离：水样通过0.22m无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释，涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。水中细菌分离的简易富集技术：在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如无菌的植物组织或土壤浸出液。通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、中温菌和嗜高温菌。3.3次代培养及纯化步骤涂布的平板经培养后，如生长出

21、菌落，则按涂布不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进行分类。用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离琼脂平板上进行筛选。细菌分离：以乳酸菌为例取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中加麦芽汁至瓶口处，封塞，25培养24-48h培养基中长出绢丝状波动物，镜检杆状，阳性染色初步断定乳酸菌 用选择性培养基分批富集培养2-3代稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落性能测定（镜检杆状，染色阳性

22、；乳酸纸层析鉴定） 乳酸生成量测定（滴定法） Rf值定性 （有机酸呈黄斑点）4.菌种分离筛选应用4.1生长因子产生菌的筛选筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进营养缺陷型试验菌生长4.2氨基酸产生菌的筛选 样品 预处理 初筛（除真菌） 在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法） 平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 u.v线杀死长好的菌落 再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈 对应到copy前相应位置，找到目的菌落目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定筛选产物含量高的菌株4.3多糖产生菌的筛选取样特点：碳水化合

23、物工业的废弃物筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。4.4放线菌的分离：以产链霉素菌种的分离为例取工业发酵液（含孢子）样品1环，放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀采用稀释法制平板，获取单菌落 斜面保藏高产菌恢复 根据高产菌的特点，选择目的菌落 放大培养，发酵液性能测试4.5真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例 取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 稀释分离法 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（2） 在麦芽汁固体培养基上，25培养48-72h 形态筛选根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用 纯化，采用平板分离法进一步

24、纯化，至少反复三次 生成子囊孢子速度测定 性能测定 发酵力测定 热死温度测定 凝集力测定 双乙酰含量测定三、发酵工业菌种选育1.工业菌种改良目的及方法：提高目标产物的产量 提高目标产物的纯度，减少副产物 改良菌种性状，改善发酵过程 改变生物合成途径，以获得高产的新产品 方法：基因突变：自然选育、诱变育种；基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程2. 自然选育：2.1定义：利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰退型菌株，从中选择维持原有水平的菌株，又称自然分离。自然状态下，发生突变的概率为10-8-10-92.2自然突变有两种情况：一种是生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰

25、退和生产质量的下降，这种突变为负突变；=另一种是生产上希望看到的，对生产有利，这种突变为正突变。2.3自然选育（菌株的分离纯化）基本操作单细胞（孢子）悬液的制备平板分离挑选单菌落（注意形态的观察）发酵实验2.4自然选育流程图生产菌种斜面制备单孢子悬浮液分离出单菌落斜面种子高产菌株高产菌株沙土管菌种斜面种子摇瓶复筛高产纯化株生产试验 进一步选育或保藏3.诱变育种3.1将生物体暴露于物理、化学或生物诱变剂作用下，促使生物体发生突变、提高变异幅度，从而选出优菌种的过程。即用各种物理、化学、生物的因素人工诱发基因突变进行的筛选。3.2诱变育种步骤原种（出发菌株）纯化斜面培养完全培养基同步培养离心洗涤玻

26、璃珠震荡分散过滤单细胞或孢子悬浮液 自然分离（对照液）活细菌计数诱变处理诱变处理预备实验处理液活菌计数平板分离形态变异并计算其变异率斜面培养初筛、复筛自然分离和再复筛保藏及扩大试验3.3诱变育种流程图 统计存活率 统计存活率 生产菌种斜面制备单孢子悬浮液诱变处理分离出单菌落斜面种子高产菌株斜面种子摇瓶复筛高产纯化株稳定性试验、菌种特性考察放大、菌种保藏3.4诱变剂：凡能提高生物体突变频率的物质称诱变剂。物理诱变剂：紫外线、X射线、射线、快中子、离子束化学诱变剂（共三类）：烷化剂：如亚硝基胍（NTG）、硫酸二乙酯（DES）、乙烯亚胺（EI）、氮芥 作用机制：使核酸的氮原子上烷基，从而使配对错误。

27、核酸碱基类似物：5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，2-氨基嘌呤作用机制：作为DNA的成分渗入DNA分子中，使DNA复制时发生错配。其他诱变剂：亚硝酸能使嘌呤或嘧啶脱氢，改变核酸结构和性质，造成DNA复制混乱；叠氮化钠是一种呼吸抑制剂，能引起基因突变，可获得较高的突变频率，且无残毒。生物诱变剂：噬菌体，转座子生物诱变剂有三种诱变方式：转导诱发突变、转化诱发突变、转座诱发突变3.5菌种诱变的方法诱变育种包括出发菌种选择、诱变处理和筛选突变株三个部分。 第一步：i出发菌种选择原则：选取纯种作为出发菌株；选择具有优良性状的菌株；对诱变剂敏感的菌株ii处理单孢子（或单细胞）悬液：芽孢杆菌应处理芽孢；放线菌，霉

28、菌应处理孢子；细菌指数期，放线菌、霉菌要稍加萌发后使用；出发菌株应制成均匀悬液第二步：诱变处理诱变剂的使用：剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示合适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正变范围的剂量诱变增强剂:如LiCl第三步：突变株的选择随机筛选摇瓶筛选法琼脂块筛选法筛选自动化和筛选工具微型化高效摇瓶筛选方案第一轮 诱变剂处理 初筛（每株1瓶） 复筛（每株4瓶）一个出发菌株选出200个单孢子菌菌株选出50株选出5 株第二轮 诱变剂处理 初筛（每株1瓶） 复筛（每株4瓶）五个出发菌株每个菌株选出40株选出50株选出5株春日霉素高产菌种琼脂块培养筛选法春日霉素产生菌的孢子悬液 诱变3.6理性化筛选

29、筛选营养缺陷型筛选细胞膜透性改变的突变株 筛选油酸缺陷型或甘油缺陷型筛选结构类似物抗性突变株 结构类似物一方面与代谢物结构相似，有相似的反馈调节作用；一方面不同于代谢物不具有正常的生理功能，使细胞死亡。 添加此类物质，大部分细胞缺少该种初级代谢物而死亡，生长下来的菌株对此结构类似物不敏感，不受此反馈调节抑制。利用回复突变筛选抗反馈突变株先选对产物敏感的菌株，再诱变处理得到恢复突变株（改变酶的调节位点，不受产物的反馈抑制）3.7黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制 结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV营养缺陷型：如Thr缺陷型4.杂交育种4.1定义：将两个基因型不同的菌株经吻合

30、或接合使遗传 物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。4.2例子：一株大肠杆菌A-B+Lac-SMrT1s ,另一株大肠杆菌A+B-Lac+SMsT1r ,混合培养后，长出少数菌落。5.细菌杂交在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。5.1大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-。整合状态为Hfr。F因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌。 5.2酵母杂交育种技术5.2.1酵母繁殖方式：酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情况下，繁殖体为双倍体，但经过特定条件的诱