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1、RNA干扰抑制FUBP1基因表达对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响中文论著摘要RNA干扰抑制FUBP1基因表达对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响南方医科大学 刘一柏目 的构建针对靶向基因FUBP1（far upstream element binding protein 1，FUBP1）的慢病毒载体LV-FUBP1-RNAi，转染胃癌SGC-7901细胞，探讨应用RNA干扰技术抑制FUBP1基因的表达对人胃癌细胞增殖、细胞迁移、细胞周期和凋亡等生物学功能的影响，初步评价FUBP1基因沉默在胃癌基因治疗中的应用价值。方 法构建三组不同RNA干扰序列的慢病毒载体LV-FUBP1

2、-RNAi及阴性对照序列的慢病毒载体Negative-RNAi，通过慢病毒转染预实验选择合适的感染复数分别转染胃癌细胞SGC7901后利用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(QRT-PCR)检测FUBP1在mRNA的表达水平，筛选出有效的RNA干扰序列用于后续实验。将实验分为FUBP1-RNAi组、Negative-RNAi阴性对照组（标记为NC）和空白对照组（标记为CON），应用QRT-PCR 及蛋白免疫印迹（Western blot）检测FUBP1在mRNA和蛋白质水平的表达量。应用CCK-8法检测各组细胞增殖、Transwell及划痕实验检测各组细胞迁移能力、流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况

3、及细胞凋亡。结 果成功构建了三组不同RNA干扰序列的慢病毒载体FUBP1-RNAi-KD1、FUBP1-RNAi-KD2、FUBP1-RNAi-KD3；通过慢病毒转染预实验选择MOI=30的感染复数成功转染各组胃癌SGC7901细胞并筛选出有效的RNA干扰序列FUBP1-RNAi-KD2（相对于NC组FUBP1抑制效率高达70.4%）；QRT-PCR结果显示：相对于NC组，RNA干扰组（FUBP1-RNAi-KD2）FUBP1 mRNA的表达量明显下调，抑制率达70.4%（P0.05）；Western blot结果显示：相对于NC组，RNA干扰组FUBP1 蛋白质的表达量明显下调，抑制率达74

4、.4%（P0.05）；CCK-8结果显示：相对于NC组和CON组，RNA干扰组连续5天胃癌细胞增殖倍数降低（P0.05）；PI-FACS细胞周期检测结果显示：相对于NC组和CON组，RNA干扰组S期细胞比例明显升高（达60.74%，P0.05），G0/G1期和G2/M期细胞比例分别降低达30.48%（P0.05）、8.78%（P0.05）。结 论慢病毒载体FUBP1-RNAi-KD2介导的FUBP1基因沉默能够有效的抑制FUBP1在人胃癌SGC7901细胞系内mRNA和蛋白质水平的表达量；通过RNA干扰技术沉默FUBP1基因的表达能够抑制胃癌细胞SGC7901的增殖，影响细胞周期的分布，将细胞

5、周期阻滞在S期，抑制细胞生长；但是对细胞凋亡及迁移能力无明显影响；通过RNA干扰技术特异而有效的沉默FUBP1基因在胃癌的基因治疗中具有一定的价值。关键词RNA干扰；慢病毒转染；远端上游元件结合蛋白1；胃癌；基因治疗英文论著摘要The effect of RNA interference inhibiting FUBP1 gene expression on the biological function of human gastric cancer cell line SGC7901ObjectiveThis paper aimed to construct FUBP1-RNAi lent

6、iviral vector to transfect into human gastric cancer cell line SGC7901 and investigate the effect of inhibiting FUBP1 gene expression on the biological function of gastric cancer cell proliferation, metastasis, cell cycle and apoptosis. Through this study, we can evaluate the value of FUBP1 gene sil

7、encing in the treatment of gastric cancer.MethodsTo design FUBP1-RNAi lentiviral vector with three different kinds of RNA interference sequences and Negative-RNAi lentiviral vector with negative control sequence. Then choice the reasonable MOI via preliminary experiment of lentiviral transfection to

8、 transfect into human gastric cancer SGC7901. The quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (QRT-PCR) was used to detect the mRNA expression level of FUBP1 to select the effective RNA interference sequence which was used in the following experiment. We divide the experiment into t

9、hree groups, which were FUBP1-RNA interference group, Negative-RNAi control group and blank control group. The QRT-RCR and Western blotting were used to detect the mRNA and protein expression level of FUBP1. CCK-8 was used to detect cell proliferation of each group. Transwell and Scratch Test were u

10、sed to detect the acticity of cell migration. PI-FACS were used to detect Cell cycle distribution and apoptosis of each group.ResultsLentiviral vector with three different kinds of RNA interference sequences were successfully constructed, including FUBP1-RNAi-KD1, FUBP1-RNAi-KD2 and FUBP1-RNAi-KD3.

11、Then choice MOI=30 via preliminary experiment of lentiviral transfection to transfect into human gastric cancer SGC7901 and select FUBP1-RNAi-KD2 as the effective RNA interference sequence (inhibition rate of FUBP1 was up to 70.4% Which compared with Negative-RNAi group). Compared with Negative-RNAi

12、 group, RT-PCR and Western blotting results showed that the mRNA and protein expression level of FUBP1 gene in FUBP1-RNAi-KD2 group were respectively reduced by 77.6%(P0.05) and 74.4%(P0.05). The CCK-8 test showed that gastric cancer cell proliferation fold in five days of FUBP1-RNAi-KD2 group were

13、decreased (P0.05) Which compared with negative control group and black control group. Flow cytometry results showed that the number of gastric cancer cell in S phase of FUBP1-RNAi-KD2 group was up to 60.74%(P0.05) Which compared with Negative-RNAi group and black control group, while the number of g

14、astric cancer cell in G0/G1 phase and G2/M phase were respectively decreased to 30.48%(P0.05) and 8.78%(P0.05).ConclusionsSilencing of FUBP1 gene via FUBP1-RNAi lentiviral vector can effectively suppress the mRNA and protein expression level of FUBP1 in gastric cancer cell SGC7901. Silencing of FUBP

15、1 gene can effectively inhibit gastric cancer cell proliferation, affect distribution of cell cycle, arrest cell cycle in S phase to suppress cell growth.While there is on significant effect on apoptosis and migration. The specific and effective silencing of FUBP1 gene via RNA interference technique

16、 has a certain value in the gene therapy of gastric cancer.Key wordsRNA interference; lentiviral transfection; FUBP1; gastric cancer; gene therapy 英文缩略语表英文缩写英文全称中文译名FUBPFar upstream element binding protein远端上游元件结合蛋白RNARibonucleic acid核糖核酸RNAiRNA interferenceRNA干扰dsRNADouble stranded RNA双链RNAsiRNAsma

17、ll interfering RNA小干扰RNARISCRNA indeced silencing complexRNA诱导的沉默复合物FUSEFar upstream element远端上游元件TFIIHTranscription/repair factor IIH转录修复因子IIHFBSFetal bovine serum胎牛血清PBSPhosphate buffer saline磷酸盐缓冲液DMSODimethyl sulfoxide二甲基亚砜RT-PCRReverse transcription-polymerase chainreaction逆转录-聚合酶链反应WBWestern B

18、lot免疫印迹法RnaseRibonuclease核糖核酸酶DEPCDiethypyrocarbonate焦炭酸二乙酯PAGEPolyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDSSodium dodecyl sulfonate十二烷基磺酸钠TBSTTris-Buffered Saline Tween-20缓冲液PVDFPolyvinylidene fluoride聚偏二氟乙烯ECLElectrochemiluminescence电化学发光MOIMultiplicity of infection感染复数ODOptical density光密度论文RNA干

19、扰抑制FUBP1基因表达对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响前 言胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，尤其是在发展中国家，具有恶性程度高、发展迅速、预后差等特征。在常见癌症中，胃癌的发病率居第四位，致死率居第三位。根据2012年全球癌症统计数据显示，胃癌的新发病例数接近100万，其中超过70万病例的患者发生死亡，数据显示几乎一半以上的胃癌患者来自中国。随着早期胃癌诊疗技术和水平的不断发展提高，胃癌的发病率和死亡率都有所下降，但是进展期患者的预后仍然比较差，胃癌患者的五年生存率仍然比较低，而传统的治疗方法已不能满足胃癌发展的现状，因此，寻找胃癌基因治疗的方法成为目前研究的热题。RNA干

20、扰是真核生物体内一种基因沉默现象，具有高度的保守性和特异性。首先由Guo和Kemphues等在1995年利用反义RNA抑制秀丽隐杆线虫基因表达的过程中发现并证实反义RNA和正义RNA均能有效抑制C.elegans par-1基因的表达，但是这种现象产生的原因并未得到解释。随后，Fire等人在1988年通过研究发现dsRNA能够识别内源性mRNA的特异性序列，诱导mRNA的降解从而抑制特定基因的表达，并且比单链反义RNA或正义RNA抑制基因表达的作用更强，后来这种现象被称为RNA干扰(RNA interference, RNAi)。RNA干扰机制可以简单的概括如下，由于外源性基因的入侵诱导体内细

21、胞产生长双链RNA，这些长dsRNA在核酸内切酶Dicer作用下被分割成许多小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)，siRNA长约21-23个核苷酸片段，之后siRNA再与一些核酸酶复合物结合，形成RNA诱导的沉默复合物(RNA indeced silencing complex, RISC)，活化后的RISC能够与目的mRNA特异性结合，从而抑制目的基因的表达。近几十年来随着分子生物学技术和遗传学的不断发展，人们逐渐认识到RNA干扰作为一种强大而有效的基因沉默技术能够特异性的抑制肿瘤相关致癌基因的表达而被广泛应用于胃癌的研究中。 远端上游元件结合蛋白(FUB

22、Ps)是由FUBP1、FUBP2和FUBP3三种调节蛋白所组成的DNA结合蛋白家族，而c-myc作为原癌基因通过编码一种重要的转录因子家族参与细胞生长、增殖、分化及凋亡。1990年，Avigan等研究发现在未分化的白血病细胞内，FUBP1通过与远端上游元件FUSE结合调控c-myc基因的转录表达，首次证实FUBP1是一种DNA结合蛋白。随后一些研究表明，FUBP1在多种恶性肿瘤中呈表达上调，与c-myc基因的表达呈正相关，影响c-myc基因所介导的细胞生长、增殖、分化及凋亡，从而导致多种癌症的发生、发展。本课题应用RNA干扰技术使FUBP1基因表达沉默，通过体外细胞实验观察FUBP1沉默后对人

23、胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响，初步探讨RNA干扰技术在胃癌基因治疗中的应用价值。实验材料与方法一、实验材料（一）实验对象人胃腺癌细胞株SGC-7901（山东省肿瘤医院基础实验中心提供）（二）实验试剂与仪器1、细胞培养及转染（1）主要试剂与溶液 RPMI1640基础培养基 美国Gibco公司胎牛血清（FBS）美国Gibco公司磷酸盐缓冲液（PBS）北京鼎国昌盛生物技术有限公司 青/链霉素混合液 美国Gibco公司 0.25%胰酶美国Gibco公司 二甲基亚砜（DMSO） shRNA慢病毒载体 Polybrene原液 感染增强液（Eni.S.）美国Gibco公司上海吉凯基因科技有限公司

24、上海吉凯基因科技有限公司上海吉凯基因科技有限公司（2）主要试剂的配置 15%RPMI1640完全培养基取1640培养基420ml，加入FBS 75ml，加入5ml双抗（青/链霉素混合液），置于4冰箱保存备用。细胞冻存液按照DMSO ：1640培养基：FBS的比例为1：7：2进行配制，冻存细胞时现用现配。Polybrene稀释液Polybrene原液（10mg/ml）用RPMI1640基础培养基稀释200倍，至终浓度为50ug/ml，置于-20冰箱保存备用。（3）主要仪器设备级生物安全柜新加坡ESCO公司二氧化碳培养箱日本SANYO公司微量移液器 德国Eppendorff公司倒置显微镜倒置荧光显

25、微镜日本Olympus公司日本Olympus公司BY-R18医用低速离心机BIO-RAD公司冷藏冷冻箱（4、-20）青岛海尔股份有限公司超低温冰箱（-80）日本SANYO公司电热恒温水槽细胞培养板细胞计数板山东潍坊精密医疗器械有限公司美国Costar公司美国Coster公司2、RT-PCR（1）主要溶液与试剂 Trizol试剂美国Invitrogen life technologiesDEPC处理水（无RNase ）大连宝生物工程有限公司氯仿上海试剂一厂异丙醇 上海试剂一厂无水乙醇上海试剂一厂反转录试剂盒日本TaKaRa公司荧光定量PCR试剂盒日本TaKaRa公司PCR引物合成Thermo F

26、isher Scientific（2）主要试剂配制的方法75%乙醇：按照无水乙醇：DEPC处理水=3: 1的比例，置于常温保存备用。（3）主要设备仪器 微量反应管 美国Axygen公司微量移液器德国Eppendorff公司SIGMA 3K30超速冷冻离心机德国Sigma-Aldrich公司NANODROP 2000分光光度计Thermo Fisher ScientificMyCycler型PCR仪（BIOER）美国伯乐公司LightCycler480型PCR扩增仪德国Roche Diagnostics公司超低温冰箱（-80）日本SANYO公司3、Western blot（1）主要溶液与试剂兔抗

27、人FUBP1单克隆抗体英国Abcam公司NP-40 lysis buffer BCA定量试剂盒5SDS-PAGE蛋白上样缓冲液美国Amresco公司碧云天生物研究所上海生工生物工程有限公司30%PAGE（聚丙烯酰胺）APS（过硫酸铵）TEMED（四甲基乙二胺）10TBST济南军区总医院检验科提供美国Amresco公司济南军区总医院检验科提供 北京索莱宝科技有限公司-actin美国Epitomics公司SDS1.0mol/L Tris（PH6.8）1.5mol/L Tris（PH8.8）德国Sigma公司济南军区总医院检验科提供济南军区总医院检验科提供蛋白质MarkerThermo Fisher

28、 ScientificPVDF膜ECL-PLUS试剂盒Millipore公司瑞典Amersham公司X线胶片显影粉上海冠龙照相材料厂医用X射线胶片中国Kodak公司（2）主要试剂配制的方法10% APS：0.1gAPS +1ml去离子水溶解，置于4保存备用。封闭液：2.5g脱脂奶粉+50ml 1TBST溶解，置于4保存备用。10ml 10%分离胶：去离子水4ml+30%PAGE 3.3ml+1.5mol/L Tris（PH8.8） 2.5ml+10%SDS 100l+10%APS 100l +TEMED 4l，混匀备用。5ml 5%浓缩胶：去离子水3.4ml+30%PAGE 0.83ml+1.

29、0mol/L Tris（PH6.8）0.63ml+ 10%SDS 50l+10%APS 50l+TEMED 5l，混匀备用。（3）主要仪器、设备5417R台式冷冻高速离心机德国Eppendorff公司SDS-PAGE蛋白电泳仪上海天能科技有限公司蛋白转膜仪上海天能科技有限公司电热恒温干燥箱山东省潍坊医疗器械厂脱色摇床兴化仪器厂显影仪美国Alpha Innotech 公司4、细胞功能学实验 （1）主要溶液与试剂 CCK-8试剂德国Sigma公司PI（碘化丙啶）德国Sigma公司RNase AFementas公司凋亡试剂盒美国eBioscience公司Transwell试剂盒GIEMSA染色液美国

30、Corning公司德国Sigma公司（2）主要仪器、设备酶标仪Thermo Fisher Scientific流式细胞仪划痕仪倒置显微镜倒置荧光显微镜Millipore公司VP scientific 日本Olympus公司日本Olympus公司二、实验方法（一）RNA干扰慢病毒载体的构建与包装 针对靶基因FUBP1的RNA干扰慢病毒载体由上海吉凯基因科技有限公司协助设计、构建、包装及测序。慢病毒载体名称为GV248，元件序列为hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，设计的siRNA干扰序列如表1所示；设计的DNA oligo序列如表2所示；慢病毒滴度如表3所示：表1 FUBP1-RNAi 序列Virus NumberTarget SeqFUBP1-RNAi-KD1TGAGTATTATAGACAACAAFUBP1-RNAi-KD2