医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序.docx

1、医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序一、目的确保人感染 H7N9 禽流感病毒核酸检测过程标准化、 规范化， 降低人为不规范操作对检测结果造成的影响，保证结果的准 确性和可重复性。二、适用范围 医疗机构临床基因扩增检验实验室按照关于医院开展人感 染 H7N9 禽流感病毒核酸检测有关工作的通知（卫办医政 函2013383号）和关于做好医疗机构人感染 H7N9禽 流感检测试剂供给保障工作的通知（卫发明电 2013 29号）有关要求，使用国家疾病预防控制中心制备或商品化试 剂盒开展人感染 H7N9禽流感病毒核酸检测工作。三、样本采集、运送和保

2、存 尽量采集病例发病早期的呼吸道样本 （上呼吸道样本包括咽 拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液 , 下呼吸道样 本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等 ）。可将鼻、咽 拭子收集于同一采样管中，以便提高检出率。患者有下呼吸 道样本时，应优先采集。根据试剂说明书对样本采集方法有关要求，制订样本采集标准操作程序（SOP，并组织样本采集人员进行培训及考核。 样本的采集应当严格按照 SOP进行。样本采集后，按照人间传染病的病原微生物名录中高致 病性禽流感病毒的相关规定进行包装，用密封容器立即送往 实验室。 若气温高时， 需放入冰块降温。 样本抵达实验室后， 应尽快进行检测，24小时内能检测的样本

3、可置于 28C暂 时保存，24小时内无法检测的样本则应置于W -70 C状态保 存。如无-70 C保存条件时，可于-20 C冰箱暂存。样本避免 反复冻融。样本采集、处理、运输及保存不当时，可因病毒 RNA降解出现假阴性结果，也可因为样本“污染”出现假阳性结果。四、PCR检测（一）样本处理 样本的核酸提取应当在样本处理区进行。按所采用的商品化 试剂盒说明书要求，取适量待检样本、阳性及阴性对照进行 核酸提取。样本应尽可能新鲜，提取过程应严防 RNA酶污染 及操作不当导致的 RNA降解。提取过程如涉及离心步骤， 应 采用低温冷冻离心机；在生物安全柜内进行加样、提取过程 中，为防止RNA降解，可将试管

4、架置于托盘内平铺的碎冰上。提取好的RNA应及时用于检测，否则应当 -70 C保存。如无 -70 C保存条件，可于-20 C冰箱暂存。（二）试剂准备 试剂准备应当在试剂准备区进行。根据所用的试剂盒，样本 可进行甲型流感病毒核酸、 禽流感 H7 亚型或 H7N9 病毒核酸 的检测。试剂的配制按所用商品化试剂盒说明书进行。除酶 混合物外，其它试剂在使用前应当在室温充分复融，混匀并 瞬时低速离心。反应液分装时尽量避免产生气泡，上机前注 意检查各反应管是否盖紧，以免管内溶液泄露污染仪器。分 装有扩增反应液的反应管应当扣盖或装入密实袋内再转移 至样本处理区。（三）加样 加样应当在样本处理区进行。加样时应当

5、使样品完全落入反 应液中， 不应有样品粘附于管壁上， 加样后应尽快盖紧管盖。按试剂、仪器说明书完成加样和 PCR反应管准备。（四） PCR扩增检测PCR扩增检测在扩增区进行。待检 PCR管转移至扩增区，按顺序置于PCR仪上，编辑样本信息，按试剂和仪器说明书设 定循环参数。（五） 结果分析 根据所用试剂盒说明书设置基线值（ baseline） 。荧光阈值（ threshold ）设定以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线 （无规则的噪音线） 的最高点为原则， 且 Ct 值应大于所设置的扩增循环数（或显示为 undet ）。使用仪器配套软件自动分析 结果。（六）质量控制 检测过程对可能出现的假阳性和假

6、阴性进行质量控制，除了 检测商品试剂盒所提供阳性和阴性对照外，每次临床样本检 测时，至少应当有 1 份弱阳性和 3 份阴性质控样本（多份阴 性质控样本设置对实验室“污染”所致假阳性的监控更为有 效），随机放在所检测标本的中间。弱阳性质控样本可为检 测阳性的灭活稀释后保存的临床样本、灭活病毒或假病毒颗 粒等，如所采用的商品化试剂盒有“内标”控制假阴性，或 弱阳性质控样本来源困难，可暂不设弱阳性质控。阴性质控 样本采用标本采集管内溶液即可。质控样本应与临床标本同 等对待，参与样本核酸提取和扩增检测全过程。 试剂盒中的阳性和阴性对照用于判断实验室的有效性，按试 剂盒说明书进行。（七）实验结果的判定与

7、解释。 按照试剂盒说明书进行。对于出现弱阳性结果的样本应进行 重复检测，并注意与可能的实验室轻度或样本交叉“污染” 所致假阳性结果区别。五、检测结果报告 按照试剂盒说明书进行。六、其它注意事项（一）人感染 H7N9 禽流感病毒实验室活动、样本采集和运 输按照人间传染的病原微生物名录中高致病性禽流感病 毒进行管理。从事人感染禽流感检测的技术人员必须经过生 物安全培训并具备相应的实验技能，在检测过程中必须采取 生物安全防护措施（使用眼罩、 N95 型口罩等）。样本核酸 提取必须在口级生物安全实验室，经过年检合格的二级生物 安全柜内进行。实验室应具有良好的通风。（二） 注意仪器设备的日常和定期维护，

8、加样器、扩增仪和 温育设备应进行定期校准。 试剂盒及一次性使用的无 DNA 酶 和RNA酶PCR反应管、离心管、带滤芯吸头等应进行每批质 检。（三） 实验应严格分区操作；各区物品、工作服等均应当专 区专用，不得交叉使用。实验后应及时清洁工作台，以防污 染。（四） 每批实验室后，可采取实验室通风、 10%次氯酸钠溶液擦洗地台面、紫外照射等措施，消除可能存在的扩增产物 气溶胶污染。（五） 使用中国疾控中心制备试剂开展检测工作时，可参考 相应试剂盒说明书（见附件 1、 2）有关要求。附件：亚型禽流感病毒 RNA检测试剂盒（荧光PCR法）说明 书 禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）说明书H7

9、N9 亚型禽流感病毒 RNA 检测试剂盒（荧光PCR法）说明书【产品名称】通用名称：H7N9亚型禽流感病毒 RNA检测试剂盒（荧光PCR 法）英文名称： Diagnostic Kit for H7N9 subtype avian flu virus RNA （Fluorescence PCR）【包装规格 】48 人份/ 盒。【预期用途】本试剂用于对咽拭子样本中 H7N9亚型禽流感病毒 RNA进行定性检测，用于 H7N9 禽流感病毒感染的辅助诊断及流行病 学监控。【检验原理】根据荧光PCR技术原理，针对H7N9亚型禽流 感病毒的 HA 基因和 NA 基因设计特异性引物和 Taqman 探 针，通

10、过荧光PCR检测仪进行检测，从而实现对 H7N9亚型禽流感病毒RNA的定性检测。试剂盒以正常人上皮细胞中广 泛存在的核糖核酸酶 P（ RNase P的mRNA为正常人体细胞 对照，对提取和检测过程进行监控。【主要组成成分】名称成分规格数量（管）H7反应液含内标RNP、H7亚型特异基因的引物探针混合液管1N9反应液含内标RNP、N9亚型特异基因的引物探针混合液管1DNA聚合酶DNA聚合酶，不可用其他同类 DNA聚合酶替代60 卩 l 管1逆转录酶:逆转录酶，不可用其他冋类逆转录酶替代60 卩 l 管1阳性对照RNP、H7、N9 RNA假病毒混合物管1阴性对照DEPC水管1本品各组成成分均不得与其

11、他产品或不同批号产品中的相应组成成分进行互换。本品不包含，但对试验必须的设备和试剂：生物安全柜、台式离心机、旋涡震荡器、拭子、采样管、无菌病毒采样液、 ml无核酸酶的离心管、全自动荧光 PCR检 测仪专用PCR扩增管和核酸分离试剂盒（硅胶膜吸附法，北京 金豪制药股份有限公司， Cat： BJH101。【储存条件及有效期 】-20 C冷冻保存，有效期2个月，阳性 对照反复冻融次数不得超过 5次。【适用仪器】RG3000 LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism7000型全自动荧光 PCR检测仪。【样本要求】1样本类型：咽拭子。推荐使用金豪公司生产的微生物采样 及运

12、送管（12人份/盒）。2.拭子、采样管和保存液：拭子选择：应使用头部为合成纤维（例如，聚酯纤维），杆部为铝或塑料的拭子。采样管：外螺旋口、耐-70C冻存，可容纳3 ml病毒采样液。 无菌病毒采样液：应含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生 产的抗生素，缓冲液，经无菌处理。3.样本采集、运输和保存：由于 H7N9 亚型禽流感病毒为呼吸道传播病毒，有关生物安 全应按照“人间传染的病原微生物名录”中高致病性禽 流感病毒进行管理。采集：采集病人发病 3 日内的咽拭子标本，用于病原检测。 用微生物采样及运送管内的采样棉签，适度用力拭抹咽后壁 和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有 3ml 保存

13、液的 15ml 外螺旋盖采样管中， 在靠近顶端处折断棉 签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别 号码的标签。4C暂存并在48小时内送达实验室。保存和运输：新鲜采集样本应在 4C条件下48小时运送到检 测实验室。保存样本可在-20 C以下低温冷冻保藏， 需长期保 存的标本存于-70C冰箱。冷冻样本应在冷冻条件下送至实验 室。运输时在包装箱内填充吸水材料，运输过程中保持标本 采集管直立状态，不能倾斜。样本送至实验室后，立即进行处理和分装，避免反复冻融。临床样本保存在4C不能超过4天。4.咽拭子标本的处理 咽拭子要在标本保存液中充分搅动（至少 40 下），以洗脱 拭子上粘附的病毒及含有

14、病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在4C条件下，lOOOOrpm离心20分钟，用上清接 种细胞或直接提取 RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过 滤除菌。【检验方法】1. 核酸提取：取200卩I咽拭子样本进行核酸提取。 采用北京金豪制药股份 有限公司的核酸分离试剂盒 （硅胶膜吸附法 ），该试剂盒可用 于对呼吸道悬浮液样本中的病毒 RNA提取，并按试剂盒说明 书要求操作。本品的阳性对照和阴性对照均参与核酸提取。. 准备及注意事项：分别在洗液A瓶和洗液B瓶中加入16ml和60ml无水乙醇， 颠倒充分混匀，并在瓶身上加以标识。吸取所需的洗脱液，

15、加至一无核酸酶的 eppendorf 管中， 于70 C预热。冷冻样本应室温融化，轻微震荡混匀后使用。区分操作中的离心设置 （rpm和g）,本产品操作过程均为 室温离心。助沉剂在低温保存时可能呈胶状，吹打混匀即可使用。. 样本裂解及核酸吸附在无核酸酶的离心管中加入 10 L I助沉剂和400卩I裂解液， 加入200卩I待处理样本，剧烈震荡 2分钟，室温静置10分 钟。注：如样本体积小于或大于 200卩I，需按比例改变助沉剂、裂解液以及无水乙醇体积。 体积大于400卩I样本应分多次进 行处理。加入480卩I无水乙醇，颠倒混匀，吸取600卩I裂解混合物 转移到核酸吸附柱中。注：如样本体积小于或大于

16、 200卩I,需按比例改变乙醇用量。3500g 离心 2 分钟，取下套管，倒掉套管中的液体。将剩 余裂解混合物转移至核酸吸附柱，重新离心一次，弃套管中 的液体。将核酸吸附柱重新装入套管， 6000g 离心 1 分钟，倒掉套 管中的液体。. 核酸纯化将核酸吸附柱重新装入套管，在核酸吸附柱中加入 500卩I洗液 A， 6000g 离心 1 分钟，将核酸吸附柱装入一个干净套 管中。在核酸吸附柱中加入 500卩I洗液B,静置1分钟，6000g 离心 1 分钟。倒掉套管中的液体，将核酸吸附柱重新装入套管。重复一次步骤 （本步骤不用静置 1 分钟 ）。将核酸吸附柱换一新套管， 13000rpm 离心 3

17、分钟。. 核酸洗脱将核酸吸附柱装入一无核酸酶离心管，小心在吸附膜中央加入50卩I预热洗脱液，室温静置 4分钟。10000 rpm 离心 2 分钟，离心管中液体即待测样本 RNA。2.PCR扩增：实验设计：待检样本检测：每份样本分别使用 2 种反应液（ H7 和 N9 反 应液）进行检测，综合 2 种反应液的检测结果对样本进行判定。对照品检测：每次试验都应设置阴性对照和阳性对照。 反应体系的配制：准备工作：将 2 种反应液（ H7 和 N9 反应液）融化后振荡混 匀，离心 6000rpm 10 秒。2种反应体系（H7和N9）的配制：取2个无核酸酶离心 管，计算待测样本数量（n），分别取20卩IX

18、 （ n+2）反应液（H7 和N9）、卩I X（ n+2） DNA聚合酶和卩I X（ n+2）逆转录酶 充分混匀，离心 6000rpm 10 秒。n + 2 = n 份样本 +1份阳性对照 +1 份阴性对照；反应体系分管：每份待测样本设置 2个PCR扩增管（H7和N9）,分别将每 种反应体系按20卩I/管分装至对应的PCR扩增管中。加样：每份待测样本 RNA、阳性对照、阴性对照以5卩1/管分别加入 2个PCR扩增管中。扩增检测：将加样后的PCR扩增管分别转移到全自动荧光定量 PCR检测仪上进行扩增检测，不同仪器的设置如下：全自动荧光定量 PCR检测仪（RG3000、ABI Prism 7500

19、、ABI Prism 7000型）扩增程序：对于ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自动荧光定量 PCR 检测仪，荧光信号设置为： Reporter Dye1 : FAM、JOE/VICQuencher Dye1: NONE， Passive Reference: NONE。其他型 号仪器可设置为 FAM和HEX通道。荧光PCR扩增程序的设 置见表1。反应总体积为25卩I。表1.荧光PCR扩增程序步骤反应温度时间是否采集光循环数逆转录及变性50 C30分钟否195 C3分钟否预扩增95 C15秒否550 C30秒否72 C1分钟否扩增及荧光收集95 C10秒否4055

20、 C40秒是全自动荧光定量 PCR仪（Roche LightCycler系列）扩增程序:选择FAM、HEX通道收集荧光。荧光 PCR扩增程序见表2 表2.荧光PCR扩增程序|步骤反应温度时间是否采集荧光循环数逆转录及变性50 C30分钟否193 C3分钟否预扩增93 C15秒否550 C30秒否72 C1分钟否扩增及荧光收集93 C10秒否4055 C40秒是3.结果分析：本品H7荧光探针的报告荧光为 FAM, N9荧光探针的报告荧光为FAM,RNP荧光探针的报告荧光为 HEX所以应选择FAM 通道和HEX通道分析试验结果。基线（Baseline）范围根据仪器要求设定，目的为校正背景荧光干扰，

21、终止循环（End） 般设置为最强样本出现扩增信号的前3-4个循环。阈值线用于判断样本是否扩增，应调整使阈值线高于荧光背景和阴性对照的荧光信号，或点击分析（ Analysis）自动获得。4.质量控制：每次试验应设置阳性对照和阴性对照，且应符合以下要求，否则试验结果不成立。阴性对照无Ct值或Ct值为0。阳性对照Ct值小于。【参考值（参考范围）】Ct值w报告该反应阳性；无Ct值或Ct值为0报告该反应阴性；v Ct值v为灰区；内标RNP有效的范围为：Ov Ct值v；【检验结果的解释】1.在内标RNP结果成立的条件下各种判读模式如下:反应液模式1模式2模式3模式4H7-+N9-+-+RNP+结果判断H7

22、N9亚型禽流感病毒RNA阴性H7N9亚型禽流感 病毒RNA阴性H7N9亚型禽流感 病毒RNA阴性H7N9亚型禽流感 病毒RNA阳性注：在内标RNP结果不成立的条件下视为检测异常，应重新采样检测。2.结果在灰区的样本需重复试验：取 200卩I样本重新提取RNA (核酸分离试剂盒中裂解液、无水乙醇的用量加倍，其 他组分的用量不变)并检测。复检结果 Ctv的样本为阳性，否则为阴性。3.内标RNP检测靶物质为正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶P ( RNase P的mRNA,用于对样本中 RNA的提取 和扩增检测过程进行有效监控。如果该份样本的 RNP检测Ct值，可能为以下原因：未采集到足够的正常人

23、上皮细胞，应重新采样。核酸提取过程异常，导致 RNA损失，应重新提取。样本中存在RT-PCR抑制物质，可稀释后检测；【检验方法的局限性】1.样本中RNA浓度低于本产品的最低检出值(100copies/ml ) 时可能出现假阴性。2.目前研究显示，发病后两日内取样检测，病毒 RNA 检出率最高，随发病时间的延长，病毒被清除，病毒核酸的检出水 平迅速下降。因此应在发病后尽早采样，必要时可采用多部 位取样检测。临床评价应结合其他临床症状和实验室检测指 标进行判断。【产品性能指标】1.本品可最低检出 100copies/ml 稀释物。2.本品对季节性流感（H1N1以及H3N2）灭活病毒、B型流 感灭活

24、病毒、高致病性禽流感灭活病毒（ H5N1） RNA进行检 测，结果为阴性。【注意事项】1.开始检测前请仔细阅读本说明书全文，并严格按照要求进 行操作。2.实验室配置和试验操作请按照临床基因扩增检验实验室管理暂行办法和临床基因扩增检验实验室工作规范进 行；整个检测过程应严格分区进行： PCR反应体系的配置区；标本处理、加样区；各区使用的仪器、设备、耗材和工作服 应独立专用。亚型禽流感为经呼吸道传播疾病，应按照相关要求进行。样 本的采集、处理、运输和保存均存在一定生物危害。样本的 采集、运输和保存应按照乙类传染病进行管理；标本的提取 必须在生物安全二级实验室的负压生物安全柜中完成；试验 中接触过标

25、准品和对照品的废弃物品（如吸头）、扩增完毕 的离心管、标本等应进行无害化处理后方可丢弃。4.不同批号的试剂请勿混用，请在有效期内使用试剂盒。5.本产品仅用于体外诊断检测。【参考文献】1. 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（ WS233-2002)2.人感染 H7N9 禽流感诊疗方案（ 2013 年第 2 版）3. 临床基因扩增检验实验室管理暂行办法 （ 卫医发 200210 号）【生产企业】企业名称：北京金豪制药股份有限公司 生产地址：北京市北京经济技术开发区运成街 7 号 注册地址：北京市北京经济技术开发区运成街 7 号 1 号楼邮政编码： 100176电话号码： 0传真号码： 0网 址：【医疗器械生产企业许可证编号】 京药监械生产许