海洋生物技术 1.docx

1、海洋生物技术 1第三章1细胞培养：所谓细胞培养是指将有机体内的某一组织，如动物的肝、肾或肌肉等取出，分散成单个细胞，在人工条件下使其存活、生长和分裂的技术。2细胞培养：使用单个细胞悬液(是把取得之组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，然后进行培养生长。)3组织培养：使用组织块（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）(把活体的一小片组织置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长)4器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫(系将活体中器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。)5原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养（在

2、培养条件下传 至 代 ）。6传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中（一般可传 至 代的细胞 ）。7细胞株（cell strain）：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞的生长就要出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可能度过危机而传下去。这些存活的细胞一般又可顺利地传40-50代次。并且保持原来的染色体的二倍体数量及接触抑制的行为。此类细胞成为细胞株。从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞株(cell strain)。所以细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标

3、志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。 8细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系， 由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限， 可称为有限细胞系(finite cell line)， 如可以连续培养， 则称为连续细胞系(continuous cell line)， 培养50代以上并无限培养下去。当细胞株传至50代以后又要出现危机，不能再传下去了。但有部分发生了遗传突变，并带有癌变的特点，这种细胞有可能在培养条件下无限地传下去，这类细胞称为细胞系。9原代培养细胞的生命归宿 原代培养期 传代期 衰退期10培养细胞的生长方式

4、贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长,见于各种实体瘤细胞;悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面,见于各种造血系统肿瘤细胞。11贴附生长细胞的生长过程游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟4小时贴壁。潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂， 机制：接触抑制、密度依赖性。12血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原

5、等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）。24细胞传代方法1.悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2.半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3.贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代，常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。25贴壁生长细胞传代方法1 吸光培养瓶中

6、的培养液；2 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），静置2-10 min（显微镜下动态监测）；3 吸去胰蛋白酶液，加入新鲜培养液；4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液；5 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内；6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内；7 将后者放入培养箱中培养。28细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。29冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如

7、果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。31低温保护剂的应用在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO（二甲基亚砜），它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。32细胞冻存方法1预先配制冻存液： 含20%血清培养基 10% DMSO 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬

8、液（1106 5 106细胞/ml)3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4 年后，存活率可达80一90。DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。33细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。34细胞分离方法非酶消化法:1.直接分离法（机械法和EDTA螯合法）2.组织块培养法酶消化法:1.胰酶消化（条件较难掌握）2.胶原酶消化（两步灌流法）3. Dispase （中性蛋白酶）1.胰蛋白酶 (Tr

9、ypsin) 在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成34mm小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。 将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml 胰蛋白酶）。 在4孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。 移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。 在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。 通过无菌不锈钢丝网（100200

10、mm）过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。 2.胶原酶 (Collagenase) 用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成34mm小片，用Hanks平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次。 加入胶原酶（50200单位/ml，溶解在HBSS中）。 在37孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率。 通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。 通过离心在HBSS中清洗悬液几次。 再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。 3.Dispase 用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成34mm小片，用不

11、含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。 加入Dispase（0.62.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液） 在37孵育20分钟到几个小时。 通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase。 通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。 再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。 第五章 海洋动物的细胞操作1细胞操作又叫细胞工程是指利用细胞融合和显微操作等方法对生物体的构成单位包括体细胞和生殖细胞直接用手操作，创造出对人类有价值的物质和生命体的技术。细胞操作和染色体操作以及基因操作关系密切，所以有时将它们统

12、称为细胞操作。2常用技术： 动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植单克隆抗体的制备多莉羊的培育过程3 细胞遗传操作常用方法一、抑制细胞分裂 二、细胞融合 三、染色体失活的方法 四、染色体的观察及倍性分析五、体细胞及配子的制备 六、卵和早期胚胎细胞操作的前处理4细胞遗传操作常用方法5抑制细胞分裂1化学方法： 化学方法主要是利用能够抑制分裂的化学物质来干预细胞的分裂过程，从而达到预期的目的。常用的化学药品有：细胞松弛素B、6-二甲氨基嘌呤、咖啡因等。细胞松弛素B（CB）：是一类真菌的代谢产物，抑制细胞分裂的机制是特异性地破坏微丝，使最终导致细胞分离的由微丝构成的“收缩环”解体，抑

13、制细胞分裂。有效的使用浓度是0.51.0 mg/dm3，一般溶解在0.1的二甲基亚砜中使用。二甲氨基嘌呤（6-DMAP）：通过对磷酸化激酶的抑制，抑制一系列有磷酸激酶参与的生化反应和细胞功能，如抑制极体的形成和释放等，有效浓度为200400 mol/dm3。咖啡因：其作用效果在于提高细胞内的Ca2+浓度，而构成细胞分裂过程中的纺锤丝的微管对Ca2+浓度非常敏感，在微管自装配中Ca2+起作用， Ca2+浓度极低或高于10-3时，会引起微管二聚体的解聚，阻止分裂。使用浓度为515mmol/dm3。dm3:立方分米 2 物理方法：物理方法是在细胞分裂周期中施加物理处理影响和干预细胞的正常分裂，达到预

14、期目的。常用的方法有温度休克法和静水压等。温度休克法：其机制是引起细胞内酶构型的变化，不利于酶促反应的进行，导致细胞分裂时形成纺锤丝所需的ATP的供应途径受阻，使已完成染色体加倍的细胞不能分裂。常用温度的确定根据应用种类的不同而有所差异，一般是在该物种生存温度范围的上下限附近。水静压：利用水静压设备（液压机等）产生的压力施加于处理对象。其机制主要是抑制纺锤体的微丝和微管的形成，阻止染色体的移动，从而抑制细胞分裂。常用的压力范围是200500 kg/cm2。6细胞融合 细胞融合又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融合成一个细胞的现象。体外动物细胞的融合，一般多用灭活的仙台病毒或聚乙二醇（，PE

15、G）诱导两种细胞融合，制成一种新品系的杂交细胞，此杂交细胞具有很强的生命力，增殖旺盛。细胞融合术是细胞遗传学、细胞免疫学、病毒学、肿瘤学等研究的一重要手段，也是制备单克隆细胞株的重要技术。 单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，在生命科学研究核应用方面产生了重大影响。 1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。 2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：可促使细胞凝结；破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核融合细胞。 3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。 7染