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1、生物化学复习 生物化学知识要点1 引言 1.1 分子标记概念的界定 广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。本文中也将分子标记概念限定在DNA标记范畴。 1.2 理想的分子标记的界定 理想的分子标记必须达到以下几个要求：(1)具有高的多态性；(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3)能明确辨别等位基因；(4)遍

2、布整个基因组；(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6)选择中性（即无基因多效性）；(7)检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）；(8)开发成本和使用成本尽量低廉；(9)在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求。 2 分子标记的种类 2.1 限制性片段长度多态性 2.1.1 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism。缩写RFLP)是发展最早的分子标记技术。RFLP技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起

3、酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。此技术及其从中发展出来的一些变型均包括以下基本步骤：DNA的提取、用限制性内切酶酶切DNA、用凝胶电泳分开DNA片段、把DNA片段转移到滤膜上、利用放射性标记的探针显示特定的DNA片段（通过Southern杂交）、分析结果。由于线粒体和叶绿体DNA较小。 前三个步骤就完全可能检测出DNA片段的差异，所以往往不必要后面的几个步骤；对线粒体和叶绿体DNA进行的这种多态性差异检测在1980年之前就已出现，从理论上说，这种多态性也可称为RFLP。 2.1.2 一

4、般选择单拷贝探针。但如果RFLP探针是来自拷贝数可变串联重复（Varible number of tandem repeats。缩写VNTR）。则产生另一类因相同或相近序列的拷贝数变化所引起的多态性。凡是引起重复单位的大小和序列不同、基因组中重复的数目和分布不同等均可导致这种多态性的产生。在RFLP技术中有特殊用途（成为分子标记）的重复序列包括：(1) 小卫星(minisatellite)序列：重复单位(motif)约有碱基1060个（也有16100个碱基一说），在基因组中多次出现。(2) 微卫星(microsatellite)或简单重复序列(simple sequence repeats。缩

5、写SSR)：重复单位含有1-5个碱基（也有2-8个碱基一说）2.2以PCR(聚合酶链式反应)为基础的分子标记 2.2.1 随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，缩写RAPD)： 2.2.1.1基本原理和特点：该技术用一个（有时用两个）随机引物（一般810个碱基）非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。其特点包括：(1)不需DNA探针，设计引物也不需要知道序列信息；(2)用一个引物就可扩增出许多片段（一般一个引物可扩增612条片段，但对某些材料可能不能产生扩增产物），总的来说RAPD在检测多态性时是一种相当快速的方法；(3)技术简单，

6、RAPD分析不涉及Southern杂交、放射自显影或其它技术；(4)不象RFLP分析。RAPD分析只需少量DNA样品；(5)成本较低，因为随机引物可在公司买到，其价格不高；(6)RAPD标记一般是显性遗传（极少数是共显性遗传的）。这样对扩增产物的记录就可记为“有/无”，但这也意味着不能鉴别杂合子和纯合子；(8)RAPD分析中存在的最大问题是重复性不太高。因为在PCR反应中条件的变化会引起一些扩增产物的改变；但是，如果把条件标准化，还是可以获得重复结果的12;(9)由于存在共迁移问题，在不同个体中出现相同分子量的带后。并不能保证这些个体拥有同一条（同源）的片段；同时。在胶上看见的一条带也有可能包

7、含了不同的扩增产物，因为所用的凝胶电泳类型（一般是琼脂糖凝胶电泳）只能分开不同大小的片段。而不能分开有不同碱基序列但有相同大小的片段。 2.2.1.2 RAPD技术的发展和相近的分子标记种类：下面提到的所有技术都是利用一个或两个短的富含GC碱基的随机引物：DAF(DNA amplification fingerprinting)：与RAPD技术不同的是。在DAF分析中，引物浓度更高，引物长度更短（一般58个碱基），只有两个温度循环（在RAPD中是三个温度循环），并且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，DAF通常会产生非常复杂的带型5。在DAF技术从基础上，又发展出了ASAP技术(arbitrary si

8、gnatures from amplification profiles)（使用了不同引物）4。AP-PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction)：在AP-PCR分析中，扩增分为三个部分。每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异；在第一个PCR循环中，引物浓度较高；引物长度不定。并且常常来自为其它目的而设计的引物（如M13通用测序引物）。MAAP(Multiple Arbitrary Amplicon Profiling)：这是Caetano-Anolles (1994) 3创造的一个词，想用来统称所有这些相关技术，但迄今为止这个词很少使用。

9、 2.2.2 特定序列位点 特定序列位点(sequence-tagged site，缩写STS)是对由其特定引物序列所界定的一类标记的统称。利用特异PCR技术的最大优点是它产生的信息非常可靠。而不象RAPD、AFLP和利用随机探针产生的RFLP存在某种模糊性（如难以鉴别片段的来源）。这类分子标记主要包括以下几种分子标记： 2.2.2.1 STMS(Sequence-tagged microsatellites)：通常又称为SSR，也可称为SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisms) 2.2.2.1.1基本原理和特点：引物根据与微卫星重复序列两翼的特定短序

10、列设计，用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大，所以这是检测多态性的一种有效方法。其特点包括：一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；得到的结果重复性很高。为了提高分辨力，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，它可检测出单拷贝差异。也可以在同一个反应试管中把PCR反应与不同的STMS引物结合起来（称为multiplexing），这可节省时间。但是，这只能在不同引物的产物在大小上不重叠的情况下才能使用。很显然。使用STMS技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列的信息，这一方面可以在其它种的DNA数据库中查询，否则就必须先建立含有微卫星的基因组文库，再从中筛选

11、可用的克隆，进行测序，然后设计合适的引物。 2.2.2.1.2 STMS的发展和相近的分子标记种类： 把与SSR互补的寡核苷酸作为多位点RFLP技术中的探针把与SSR互补的寡核苷酸作为PCR引物（可单独作引物或与随机引物配合使用），扩增的是基因组DNA的特定片段：即MP-PCR7和RAMPs21用标记的SSR探针与RAPD扩增片段杂交：即RAMPO15或称为RAHM或RAMS 用5?或3?端加锚的SSR作引物(如GGCA7)：即ISSR23，见2.2.2.2.2.2 加锚微卫星寡核苷酸(Anchored microsatellite oligonucleotides) Zietkiewicz

12、et al.(1994) 23对STMS技术进行了发展，他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物。 对基因组节段而不是重复序列本身进行扩增。在SSR的5?端或3?端加上24个随机选择的核苷酸，这可引起特点位点退火。这样就能导致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为ISSR (inter-simple sequence repeat)23、ASSR(anchored simple sequence repeats) 17或AMP-PCR18。这类标记往往是显性遗传的。在所用的两翼引物中，可以一个是ASSR引物，另一个是随机引物17。如果一个是5?端加锚的ASSR引

13、物。另一个是随机引物，则被RAMP技术21。 2.2.2.3 SCAR(Sequence-characterized amplified regions) SCAR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的14。其基本步骤是：先作RAPD分析。然后把目标RAPD片段（如与某目的基因连锁的RAPD片段）进行克隆和测序。根据原RAPD片段两末端的序列设计特定引物（一般比RAPD引物长，通常24个碱基）。再进行PCR特异扩增，这样就可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来。这样的位点就称为SCAR。SCAR比RAPD和其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用更好，因为它有更高的可重复性（原因是

14、使用的引物长），标记是共显性遗传的。 2.2.2.4 CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequence) CAPS技术又可称为PCR-RFLP。所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。其基本步骤是：先进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切。再用琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分开。用EB染色，观察10。与RFLP技术一样，CAPS技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。在酶切前进行PCR产物检测，其多态性称为ALP6。Neff et al. (1998) 13在此基础上又发展出dCAPS技术(derived CAPS)，这是检测单核苷酸多态

15、性的一种良好方法。 2.2.2.5 SPAR (single primer amplification reaction) SPAR技术与RAPD技术相似的是也只用一个引物，但SPAR分析中所用的引物不是随机的，而是在SSR的基础上设计的，例如可能的序列是(TA)10或(CGA)6。扩增的是SSR之间的DNA序列8。又称为MP-PCR(microsatellite-primed PCR) 19。 2.2.2.6 DAMD (directed amplification of minisatellite region DNA) 直接用小卫星的核心序列作引物进行扩增。 2.2.2.7 Inter-

16、Alu PCR like genomic profiling 与SPAR技术相近，也只用一个引物，但所用的引物是在Alu序列（为中等重复序列）的基础上设计的。扩增的是Alu序列之间的DNA序列2。 2.2.2.8 ISTR (inverse sequence-tagged repeat) 这种技术与SPAR技术也相近，也所用的引物是在copia序列反向重复序列的基础上设计的，扩增的是copia序列之间的DNA序列16。 2.2.2.9 IFLP (intron fragment length polymorphism) 检测的对象是内含子的长度差异9。 2.2.2.10 RAMPO (rand

17、om amplified microsatellite polymorphism) RAMPO的英文全名与RAMP的英文全名相近，但实验方法却不同。RAMPO的基本步骤是：先用一个单一的随机引物（即RAPD引物）对基因组DNA扩增。用电泳将扩增片段分开。 然后，把凝胶转移到尼龙膜上，使之与一个带有放射性标记（或其它标记）的与SSR互补的寡核苷酸探针（如CA8和ga8）杂交，放射自显影后可得到新的多态性类型15。 2.2.2.11 先找到RFLP标记后，对RFLP探针进行测序，再合成适当的PCR引物，这样可发现新的STS标记。这也可称为RFLP-PCR。 2.2.3 扩增片段长度多态性(Ampl

18、ified Fragment Length Polymorphism，缩写AFLP)：其特点是把RFLP和PCR结合了起来。其基本步骤是：把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3?端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增。只有那些与3?端严格配对的片段才能得到扩增)。再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。这种技术又称为“选择性限制性片段扩增”22。Arencibia et al. (1998) 1在AFLP的基础上发展出AFRP技术(amplifie

19、d fragment random polymorphism)。加的PCR引物中一侧为AFLP引物，一侧为随机引物。 2.2.4单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，缩写SNP）技术 同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异，因此在分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测是很有意义的。目前SNP作为一种新的分子标记，已有2000多个标记定位于人类染色体上，在植物上也在进行开发研究。可在胶上也可不在胶上就能检测出SNP，但检测SNP的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片技术。3. 2009年诺贝尔生理学或医学奖美国3名科学家获诺贝尔生理学或医学奖

20、2009年月日诺贝尔瑞典卡罗林斯卡医学院宣布，将2009年诺贝尔生理学或医学奖授予美国加利福尼亚旧金山大学的伊丽莎白布莱克本(Elizabeth Blackburn)、美国巴尔的摩约翰霍普金医学院的卡罗尔-格雷德(Carol Greider)、美国哈佛医学院的杰克绍斯塔克(Jack Szostak)以及霍华德休斯医学研究所，以表彰他们发现了端粒和端粒酶保护染色体的机理。卡罗林斯卡医学院方面称，这三人“解决了生物学上的一个重大问题”，即在细胞分裂时染色体如何进行完整复制，如何免于退化。其中奥秘全部蕴藏在端粒和端粒酶上。由染色体根冠制造的端粒酶(telomerase)是染色体的自然脱落物，能引发衰

21、老和癌症。端粒也被科学家称作“生命时钟”，在新细胞中，细胞每分裂一次，端粒就缩短一次，当端粒不能再缩短时，细胞就无法继续分裂而死亡。伊丽莎白？布莱克本他们发现的端粒酶，在一些失控的恶性细胞的生长中扮演重要角色。大约90%的癌细胞都有着不断增长的端粒及相对来说数量较多的端粒酶。正常人的体细胞有23对染色体。“端粒是细胞内染色体末端的保护帽，它能够保护染色体，而端粒酶在端粒受损时能够恢复其长度。”伊丽莎白布莱克本说：“伴随着人的成长，端粒逐渐受到磨损。” 端粒不仅与染色体的个性特质和稳定性密切相关，而且还涉及细胞的寿命、衰老与死亡等等。简单地说，端粒变短，细胞就老化。相反，如果端粒酶活性很高，端粒

22、的长度就能得到保持，细胞的老化就被延缓。端粒是真核细胞内染色体末端的DNA重复片断，经常被比做鞋带两端防止磨损的塑料套，由富含G的核酸重复序列和许多蛋白质组成，包括Ku70、Ku80、依赖DNA的蛋白激酶和端粒重复序列结合因子2（TRF2）等。功能是完成染色体末端的复制，防止染色体免遭融合、重组和降解。染色体复制的上述特点决定了细胞分裂的次数是有限的，端粒的长度决定了细胞的寿命，故而被称为“生命的时钟”。 端粒酶（或端粒体酶）是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶，主要成分是RNA和蛋白质，其含有引物特异识别位点，能以自身RNA为模板，合成端粒DNA并加到染色体末端，使端粒延长，从而延长细胞的寿命甚

23、至使其永生化8。端粒酶的激活或抑制会导致细胞永生化或进入分裂终止期。但是在一般的细胞中端粒酶的活性非常低，起不到什么作用。不过有一类细胞的端粒酶活性倒是非常强，因此它们可以无限地分裂下去，长生不老，那就是癌细胞！所以如果我们想要长生不老而去增强端粒酶的活性，反而可能搞得到处长癌。不过，我们可以根据癌细胞的这个特点，研制出针对端粒酶的疫苗，就有可能用来预防、治疗癌症。现在就有一些这类药物在进行临床研究。这是当初意料不到的。对端粒的研究，本来只是科学家们出于好奇，要解决遗传学的一个难题而已。4. 2009年诺贝尔化学奖 英美以三位科学家获2009年诺贝尔化学奖英美以三位科学家分享2009年诺贝尔化

24、学奖，瑞典皇家科学院2009年10月7日宣布，英国科学家万卡特拉曼-莱马克里斯南、美国科学家托马斯-施泰茨和以色列科学家阿达-约纳特3人共同获得今年的诺贝尔化学奖，其中约纳特是自1964年以来首位获得诺贝尔化学奖的女科学家。他们将平分诺贝尔化学奖奖金1000万瑞典克朗（约合140万美元）。 三位科学家因核糖体研究获诺贝尔化学奖：基于核糖体研究的有关成果，可以很容易理解，如果细菌的核糖体功能得到抑制，那么细菌就无法存活。在医学上，人们正是利用抗生素来抑制细菌的核糖体从而治疗疾病的。评委会说，三位科学家构筑了三维模型来显示不同的抗生素是如何抑制核糖体功能的，“这些模型已被用于研发新的抗生素，直接帮

25、助减轻人类的病痛，拯救生命”。核糖体是细胞器的一种，是椭球形的粒状小体，直径只有纳米左右（纳米约为十亿分之一米），几乎存在于所有细胞中。核糖体中只含两种成分：的核糖核酸（）和的核蛋白。至此，在约纳特、施泰茨、拉马克里希南等人的前赴后继下，科学家们终于能一探核糖体的工作机制，为遗传信息的传递、蛋白质翻译等重大问题提供强有力的证据，并借此弄清一些细菌的抗药机制，研发新的抗生素，帮助人体抵抗顽固疾病。生命工厂流水线的生产流程逐渐展示在人们面前，这些自然存在的生命奥秘，将帮助人类解决自身的问题。5. 细胞蛋白质相互作用的结构基础随着人类基因组计划的进行，大量基因被发现和定位，基因的功能问题将成为今后研

26、究的热点。大多数基因的最终产物是相应的蛋白质，因此要认识基因的功能，必然要研究基因所表达的蛋白质。蛋白质的功能往往体现在与其他蛋白质及/或核酸的相互作用之中。细胞各种重要的生量过程，包括信号的转导，细胞以外界环境及内环境变化的反应等，都是以蛋白质间相互作用为纽带，并形成网络。所以，近年来，蛋白质间相互作用的研究逐渐得到重视。蛋白质分子手工艺结构域有很多种，但是现在明确作为为介导蛋白质-蛋白质间相互作用的结构域并不多，这里取已明确功能的加以综述。5.1. BRCT结构域 BRCT(breast cancer susceptibility gene C terminus)结构域最先发现乳腺癌抑癌蛋

27、白BRCA1的羧基端，是一个进化上并不十分保守的蛋白质-蛋白质间相互作用的结构域，它由大约95个氨基酸残基组成，立体结构由三个螺旋围绕四条平等的折叠构成。该结构域在细胞周期相关蛋白质、DNA损伤识别，修复相关蛋白质中均有分布。例如，含有BRCT结构域的蛋白质BRCA1（乳腺癌易感基因）可以通过自身的BRCT结构域和Rb结合蛋白RbAp46、RbAp48以及Rb本身产生作用、组蛋白去乙酰化酶（HDAC1）也可与BRCA1的BRCT结构域结合1，与DNA损伤修复以及凋亡相关的蛋白P53也是BRCT结构域的作用对象，发生作用后可激活相应的基因。一种DNA修复蛋白（XRCC1）含有两个功能区域，大约由

28、100个氨基酸构成，每一个分享一个BRCT结构域。X线衍射晶体结构研究发现XRCC1能利用BRCT结构域形成同源二聚体，提示BRCT在蛋白质间起同源或异源二聚体的作用。另外XRCC1还可以利用其两个BRCT结构域，分别独立的与DNA连接酶及多聚(ADP-核糖)多聚酶结合，从而参与DNA单链断裂的修复2。5.2. LIM结构域 LIM（Lin-11,Isl-1和Mec-3基因）结构域由60个富含半胱氨酸的氨基酸残基构成，进化上相对保守，其保守组分为7个半胱氨酸残基和1个组氨酸残基，结构域通式为：C-X(2)-C-X(15,21)-FYWH-H-X(2)-CH-X(2)-C-X(2)-C-X(3)

29、LIVMF。LIM结构域可结合两个锌离子，这两个锌离子随机安置，但LIM结构域不能结合DNA分子。 对含有LIM结构域的CRP(cysteine and glycine-rich protein，丝氨酸和甘氨酸富集蛋白)的研究发现，其疏水核心对LIM结构域的立体折叠十分重要，而每一个锌离子结合区的氢键对维持锌指的几何结构是必需的。现在发现的含有LIM结构域的蛋白质较多，一般可分为三组：第一组，含有成对LIM结构域，分为A型和B型，靠近氨基末端常常但不总是含有一个同源结构域。LMO(LIM-only)蛋白，常有不多于两个的LIM结构域，它还包含一段不属于成对的LIM结构域一个小序列，也被分在这一

30、组。第二组含有一或两个单一序列型LIM结构域拷贝（C型）。第三组是一些不同来源的LIM结构域的集合，这些LIM结构域大多靠近羧基末端，常和一些附加结构域相连，其中一些可能具有和细胞骨架万分结合的能力3。来自第二组及第三组的LIM结构域可以单独和不同的配体，从立体构型分析LIM结构域可能有不止一个的结合界面。LIM结构域转录因子家族成员大多在氨基端含有两个LIM结构域，在羧基端含有一个能与DNA结合的同源结构域。两个LIM结构域转录因子家族成员要建立联系，必需通过各自的LIM结构域分别和NLI(Nuclear LIMdomain interactor,胞核LIM结构域作用子，是一种核蛋白）单体的

31、LIM结合结构域相互作用，这样就形成一个四聚体结构，从而促进远距离的增强子和启动子的相互作用。LIM结构域为以上转录因子的联系提供了纽带。LIM结构域结合蛋白（LIM domain-binding protein），也可以通过其羧基端和含有LIM结构域的蛋白质相互作用，形成复合体作为传递激活造血信号的桥梁4。 5.3. POU结构域 POU(pit-1,oct-1,oct-2,和线虫unc-86基因)结构域由70到75个氨基酸构成，位于许多真核转录因子的同源盒结构域(Ho-meobox)的上游。POU结构域有两个保守的区域，一个为POU特异结构区域，另一个是POU的同源结构域，两个亚结构域由一

32、个螺旋-转角-螺旋模块作为结合DNA的功能区，同时也参与介导蛋白质-蛋白质间的作用。现在已知，许多转录因子都可和POU结构域发生作用。POU结构域可由两个通式来描述，第一，15-27:RKQ-RLIM-X-LF-G-LIVMFY-X-Q-XDNQ-V-G。第二：S-Q-ST-TA-I-SC-R-F-E-X-LSQ-X-LI-ST。八聚体结合转录因子(octamer-binding transcription factor-1,Oct-1)含有POU结构域，它在细胞内较广泛地表达，参与激活含有八聚体模块的启动子，这些启动子与细胞周期凋控基因H2B以及核小RNA基因的表达相关。另外，Oct-1或Oct-2蛋白可通过其POU结构域与维甲类受体（RXR）的DBD(DNA binding domain,DNA结合结构域)结合，影响甲状腺素受体（RXR/TR）异源二聚体和甲