分子生物学前沿技术.docx

1、分子生物学前沿技术激光捕获显微切割 Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周【韦I组织 形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细 胞，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细 胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞相互粘附。在正常或发 育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以与体液刺激作用 于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变 化。在病理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则 这种

2、分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相 同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的 目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织 损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院(NIH)国家肿瘤研究所的2开发出激光 捕获显微切割技术(Laser capture microdissection , LCM ),次 年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系 统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确 获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组

3、织中细 胞异质性问题。这项技术现己成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一 项支撑技术 o原理：LCM的基木原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜 乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinylacetate, EVA)膜(其最大吸收峰 接近红外激光波长），在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到 该膜上。LCM系统包括倒置显微镜、固态红外激光二极管、激光控 制装置、控制显微镜载物台（固定载玻片）的操纵杆、电耦合相机与 彩色显示器。用于捕获目标细胞的热塑膜直径通常为6mm,覆在透明 的塑料帽上，后者恰与后继实验所用的标准0.5ml离心管相匹配。机械臂悬挂控制覆有热塑膜的塑料帽，放到脱水组织切片上的目

4、标部位。显微镜直视下选择目标细胞，发射激光脉冲，瞬间升温使 EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜渗透到切片上极微小的组织间隙中， 并在几毫秒内迅速凝固。组织与膜的粘合力超过了其与载玻片间的粘 合力，从而可以选择性地转移目标细胞。激光脉冲通常持续0.55.0 毫秒，并且可在整个塑料帽表面进行多次重复，从而可以迅速分离大 量的目标细胞。将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上，将所选择的细 胞转移至离心管中，从而可以分离出感兴趣的分子进行实验。EVA膜约100200 H m厚，能够吸收激光产生的绝大部分能量，在 瞬间将激光束照射区域的温度提高到90 C,保持数毫秒后又迅速冷 却，保证了生物大分子不受损害。采用

5、低能量红外激光的同时也可避 免损伤性光化学反应的发生。优缺点：LCM最显著的优点在于其迅速、准确和多用途的特性。结合 组织结构特点以与所需的切割精确度，通过选择激光束的直径大小， 可以迅速获取大量的目标细胞。LCM与以显微操作仪为基础的显微切 割技术相比，具有以下优点：（1）分离细胞速度快，无需精巧的操 作技能；（2）捕获细胞和剩余组织的形态学特征均保持完好，可以较 好地控制捕获细胞的特异性；（3）捕获细胞与塑料帽结合紧密，减少 了组织损失的风险。相比而言，除了激光切割弹射微分离系统以经 染色的用于存档的切片也可被成功进行显微切割。尽管LCM应用广泛，但对于常规染色、固定且不加盖玻片的组织 切

6、片，其视觉分辨率受到很大限制。而对于那些木身缺乏一定结构特 点的复杂组织（如淋巴组织，广泛浸润的腺癌等），要准确分离出某 一类细胞几乎是不可能的。Fend等通过采用特殊染色，尤其是免疫 组化方法，使目标细胞或想要去除的细胞变得更加醒目，从而解决了 上述难题。应用LCM,偶尔会出现无法将选择的细胞从切片上移走的情况， 出现这种结果有两种原因：（1）细胞与热塑膜之间的粘合力不足，通 常是由于组织未完全脱水或激光的能量设置过低造成的；（2）组织切 片与载玻片间的粘合力过强，通常发生在显微切割干燥时间过长的冰 冻切片。针对不同样木组织（包扌舌免疫组化染色的组织切片），一些 研究小组分别详尽报道了采用适

7、合的处理方法，以达到最佳的显微切 割条件 o应用：LCM较以往的显微切割技术有了突破性的进展，现已广泛应用 于肿瘤研究，包括前列腺癌、肾癌、肺癌、甲状腺癌、食管癌、 胃癌、肝癌、胆管癌、结肠癌、乳腺癌、胶质瘤、恶性胸膜间皮瘤、 淋巴瘤、卵巢癌等。此外，LCM还成功应用于其它一些疾病的研究中,Crohn病1肌萎缩性侧索硬化症子宫内膜异位症、获得性 免疫缺陷综合征、结核病、丙型肝炎等。而应用LCM所分离的组织也 多种多样，包括单个细胞、单一细胞群（主要是癌巢）、血管等类型。 展望：LCM成功解决了组织异质性问题，且具有迅速、准确等诸多优 点，已被广泛应用于肿瘤等疾病基因水平的研究中，并显示出了良好

8、 的应用前景。但今后可能还需要以下几个主要方面的发展和完善： 理论上，除上述组织与细胞以外，LCD还可应用于其他所有组织细胞（如脾脏巨噬细胞、肝脏Kuffer细胞等）的分离，但其各自的切片 制备、染色等技术方法尚需要进行探索；开发相应的应用程序，仅需 输入目标细胞或组织的特异性参数即可实现计算机自动控制LCD：12, 从而大大缩减所需的人力和时间；提高捕获单个细胞的精确度，以减 少非目标组织的沾染；进一步优化快速免疫组化染色的步骤，改进 DNA和RNA抽提技术，实现从少量捕获细胞或组织中获得高质量的核 酸。变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liqui

9、d chromatography, DHPLC）原理：在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间 的差异，发现DA突变。异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不 同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在 色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表 现为双峰或多峰的洗脱曲线。用离子对反向高效液相色谱法：（1）在不变性的温度条件下，检测并 分离分子量不同的双链DNA分子或分析具有长度多态性的片段，类似 RFLP分析，也可进行定量RTPCR与微卫星不稳定性测定(MSI)； 在充分变性温度条件下，可以区分单链DA或RXA分子，适用于 寡核哥酸探针合成

10、纯度分析和质量控制；(3)在部分变性的温度条件 下，变异型和野生型的PCR产物经过变性复性过程，不仅分别形成同 源双链，同时也错配形成异源双链，根据柱子保留时间的不同将同源 双链和异源双链分离，从而识别变异型。根据这一原理，可进行基因 突变检测、单核廿酸多态性分析SNPs等方面的研究。优点：近年来建立并迅速发展的DHPLC是一种新型基因突变筛查技 术，既能够自动化、高通量进行，且除PCR之外，勿需进行PCR引物 修饰、购买特殊试剂、检测标记信号或作其它的样品处理。而目前已 有的许多DNA突变分析技术诸如单链构象多态性(single-strand conformation polymorphis

11、m , SSCP) 变性梯度凝胶电泳法 (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)等均不能满足 此要求。DHPLC具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较 高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等优点。与传统的 SSCP、DGGE等方法相比,DHPLC有较多的优点。SSCP的结果受血样 质量、提取方法等因素的影响，并且需要跑胶、电泳；DGGE则需要 标记引物，存在放射性污染，这两种方法都比较费时费力。而DHPLC 则高度自动化，可以自动取样，检测每个样品只需要8分钟左右。DHPLC与其他检测DNA突变方法的最大不同在于，它能够纯化

12、DNA片 断。当然，只能检测杂合突变是DHPLC的不足之处，但是这可以利用 混合的方法(即将纯合突变样品和野生型样品混合)来解决。多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification , MLPA)于2002年由Schouten等首先报道，是近几 年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技 术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核背酸序列拷 贝数的改变，目前己经应用于多个领域、多种疾病的研究。原理：MLPA的基木原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过 连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离与数

13、据收集，分析软件对 收集的数据进行分析最后得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标 记的寡核昔酸片段，一个由化学合成，一个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中， 两个寡核苛酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分 探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶 序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条 完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只 有一个碱基的差别，就会导致朵交不完全，使连接反应无法进行。连 接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增 产物的长度都是唯

14、一的，范围在130480bp。最后，通过毛细管电 泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。只有当连接反 应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果 检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰 便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是 否有拷贝数的异常或点突变存在。应用：检测染色体亚端粒的基因重排 智力低下是遍与全世界的严重危害 儿童身心健康的一类疾患，其中一部分是由可知原因引起的，包括感 染、中毒、脑疾病等，但是很大一部分患儿的病因不明。近几年的研 究发现，包括亚端粒在内的基因重排是引起智力低下的重要原因 M, N,因为

15、亚端粒的基因非常丰富，微小的改变就会累与众多的基 因，从而导致疾病的发生。目前，应用较多的检测染色体亚端粒的方 法包括染色体核型分析，荧光原位杂交（FISH）,但是前者不能检出 亚端粒微小的基因重排，而后者费时、费力、又非常昂贵，不易推广。 MLPA-P036和MLPA-P070试剂盒，针对每一个染色体的末端都设计有 一个特异性探针，它经济、高效、快速，可以用于检测亚端粒的基因 重排P,Q,揭示部分智障患儿的发病原因。检测染色体的非整倍性改变S, T目前，检测染色体的非整倍性改 变的方法主要为染色体核型分析，但是它在检测羊水细胞、绒毛或是 其他胎儿细胞时，需要进行体外细胞培养，若培养失败、细胞

16、过少或 染色体形态较差时，常常影响实验结果。应用MLPA检测这类标本时, 不需要体外培养，少量标本即可进行检测，针对易发生非整倍性改变 的染色体（13, 18, 21, X, Y）上的几个热点基因设计特异性探针， 根据特定基因拷贝数的改变，即可确定染色体数目的异常。检测单核tF酸的多态性（SNP）和点突变 根据MLPA的原理可知，靶 序列DNA只要有一个碱基的改变，便可导致杂交不完全，使其扩增产 物缺失，因此，MLPA高度特异性的检测可用于多种SNP和点突变。几种常见的儿童遗传性疾病的检测1)智力低下综合征 多种己知的智力低下综合征与染色体特定 区域的基因改变相关。这些患儿临床表现复杂，个体差

17、异大，缺乏特 征性表现，医生很难作出准确诊断。MLPA-P064试剂盒，针对特定的 染色体区域设计了 43个探针，可以明确几种疾病的诊断A,包括： lp-缺失综合征，Williams综合征，Smith-Magenis综合征， Miller-Dieker 综合征,Digeorge 综合征W, Alagille 综合征，Sotos 综合征。根据同样的原理，MLPA-P096试剂盒可检测的疾病包插： Wo 1 fHirschhorn 综合征，Cri du Chat 综合征，WAGR 综合征，Downs 综合征等。2)X连锁型智力低下C X连锁型智力低下可以分为综合征型 和非综合征型，前者具备特征性的

18、临床表现，而后者没有特异性症状, 智力低下常常为患儿的唯一表现。目前己经发现19个基因与X连锁 型智力低下相关，MLPA-P106可以检测其中14个相关基因的改变。3)假肥大型肌营养不良症D, E, F假肥大型肌营养不良症包括 Duchenne型肌营养不良(DMD)和Becker型肌营养不良，临床表现 主要为骨盆带肌和下肢近端肌肉无力，腓肠肌假性肥大等，致病基因 位于Xp21.2,包括70多个外显子。疾病的发生与DMD基因的缺失、 重复或点突变相关。MLPA-P034和MLPA-P035试剂盒设计了 80多个 探针可以检测每一个外显子的缺失或重复突变，与部分点突变。4)Prader-Willi

19、 综合征(PWS)和 Angelman 综合征(AS) H, I PWS和AS都是由染色体15qll-13缺失或同源二倍体所致。如果是父 源性染色体15qll-13缺失或母源性同源二倍体则引起PWS,如果是 母源性染色体15qll-13缺失或父源性同源二倍体则引起AS。在人类, 父源15qll-13区域存在非甲基化的SNRPY印迹基因，母源性15qll-13 区域存在完全甲基化的SNRPN印迹基因。甲基化特异性的MLPA试剂 盒ME028采用半定量式的方式可以检测基因拷贝数的改变，探针所识 别的DNA序列包括甲基化敏感的核酸内切酶Hha I位点，因此可以分 析CpG岛的甲基化状态，从而区别PW

20、S和AS。5）其他疾病的检测MLPA还可以用于成神经细胞瘤J、a-地中 海贫血K等疾病的诊断。成神经细胞瘤是儿童中枢神经系统发生的 肿瘤，明确特征性基因的改变对确认神经肿瘤发生的过渡阶段、治疗 和预后都有重要意义，为临床提供极大的帮助。优缺点：MLPA结合了 DNA探针杂交和PCR技术，具有以下优点1、高 效：一次反应可以检测45个靶序列拷贝数的改变。2、特异：可以检 测点突变。3、快速：一次实验可以在24小时内完成。4、简便：不 同的试剂盒操作基本相同，容易掌握。MLPA虽然具有很大优点，但也有其局限性1、需要精确测量DNA 的浓度，样本容易被污染。2、不能用于单个细胞的检测。3、MLPA

21、用于检测基因的缺失或重复，不适合检测未知的点突变类型。4、不 能检测染色体的平衡易位。单核廿酸多态性SNP全称Single Nucleotide Polymorphisms是指在基因组上单个核廿 酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量 很多，多态性丰富。从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不 同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为 2： 1工 。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T, 原因是CG中的胞喀噪常被甲基化,而后自发地脱氨成为胸腺卩密唳。一 般而言,SP是指变异频率大于1 %的单核苛酸变异。在人类基因组 中大概每1000个

22、碱基就有一个SNP ,人类基因组上的SNP总量大概 是3X10飞个。因此,SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、 对药物或疾病的易曲等等都可能与SNP有关。作用和成果：SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。这主 要是因为SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病 相关基因的鉴定、药物的设计和测试以与生物学的基础研究等。SXP 在基因组中分布相当广泛，研究表明在人类基因组中每300碱基对就 出现一次。大量存在的SXP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包 括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关 基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾

23、病基因的 表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP在基 础研究中也发挥了巨大的作用，通过对Y染色体SNP的分析，使得在 人类进化、人类种群的演化和迁徙领域取得了一系列重要成果。单核苜酸多态性(single nucleotide polymorphism, SXP),主要 是指在基因组水平上由单个核廿酸的变异所引起的DNA序列多态性。 它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有己知多态性的90%以 上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就 有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉与到单个碱基的变异，这种变异可由单 个碱基的转换

24、(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱 基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等 位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常 所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换(CT,在其互 补链上则为G A),也可能是颠换(C A, G T, C G, A T)o转换的发 生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3, 其它几种变异的发生几率相似。Wang等的研究也证明了这一点。转 换的几率之所以高，可能是因为CpG二核廿酸上的胞卩密唳残基是人类

25、 基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱 去氨基而形成胸腺喀卩定。在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可 能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说， 位于编码区内的SNP(coding SXP, cSNP)比较少，因为在外显子内， 其变异率仅与周围序列的1/50但它在遗传性疾病研究中却具有重要 意义，因此cSNP的研究更受关注。从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是 同义cSXP (synonymous cSXP),即SNP所致的编码序列的改变并不影 响其所翻译的蛋口质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相

26、 同；另一种是非同义cSXP(non-synonymous cSXP),指碱基序列的改 变可使以其为蓝木翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的 功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一 半为非同义cSXPo先形成的SNP在人群中常有更高的频率，后形成的SNP所占的比 率较低。各地各民族人群中特定SXP并非一定都存在，其所占比率也 不尽相同，但大约有85%应是共通的。特性：SNP自身的特性决定了它更适合于对复杂性状与疾病的遗 传解剖以与基于群体的基因识别等方面的研究：1、 SNP数量多，分布广泛。据估计，人类基因组中每1000个核 苛酸就有一个SNP,人类30亿碱基中

27、共有300万以上的SXPsoSNP遍 布于整个人类基因组中，根据SXP在基因中的位置，可分为基因编码 区 SNPs (Coding-region SNPs, cSNPs)、基因周边 SNPs (Perigenic SNPs, pSNPs)以与基因间 SNPs (IntergenicSXPs, iSNPs)等三类。2、 SNP适于快速、规模化筛查。组成DNA的碱基虽然有4种， 但SNP般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位 基因(biallelic) o由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选 中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展 自动化技术筛选或检

28、测SNPso3、 SNP等位基因频率的容易估计。采用混和样本估算等位基因 的频率是种高效快速的策略。该策略的原理是：首先选择参考样木制 作标准曲线，然后将待测的混和样本与标准曲线进行比较，根据所得 信号的比例确定混和样木中各种等位基因的频率。4、 易于基因分型。SNPs的二态性，也有利于对其进行基因分 型。对SNP进行基因分型包括三方面的内容：（1）鉴别基因型所采用 的化学反应，常用的技术手段包括：DNA分子杂交、引物延伸、等位 基因特异的寡核廿酸连接反应、侧翼探针切割反应以与基于这些方法 的变通技术；（2）完成这些化学反应所采用的模式，包括液相反应、 固相支持物上进行的反应以与二者皆有的反应。（3）化学反应结束后, 需要应用生物技术系统检测反应结果。