附7 禽流感实验室检测技术方案范文.docx

1、附7 禽流感实验室检测技术方案范文附7 禽流感实验室检测技术方案一、实验室网络设置实验室网络由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心和省级流感实验室两级组成。二、实验室条件及生物安全操作的要求1省级流感实验室实验条件及生物安全的操作要求（1）实验生物安全要求：安全级+（BSL-2级+）或安全级（BSL-3级）。（2）特异性H5 的 RT-PCR病毒核酸检测、血清学检测中用到的血凝抑制实验（HI）可以在安全级+（BSL-2级+）实验室里操作。（3）特异性H5 的 RT-PCR病毒核酸检测在安全级+（BSL-2级+）实验室的生物安全柜里提取病毒的核酸，进行病毒核酸检测的实验室要求请参照国

2、家有关核酸检测要求的规定。（4）微量中和实验、特异性H5 的 RT-PCR病毒核酸检测阳性的采样标本的病毒分离、尸检标本的检测必须在安全级（BSL-3级）实验室里操作。（5）省级流感实验室实验条件：具备进行禽流感相关临床标本初筛所需的生物安全柜、离心机、PCR仪、电泳仪、紫外线检测仪等配套设备。2国家流感中心实验生物安全要求：生物安全级+（BSL-2级+）和生物安全级（BSL-3级）实验室。3省级流感实验室职责（1）禽流感标本特异性H5 的 RT-PCR病毒核酸检测；（2）禽流感H5的血清学检测工作; （3）特异性H5 的 RT-PCR病毒核酸检测阳性标本的病毒分离必须在生物安全级（BSL-3

3、级）实验室；（4）没有生物安全级（BSL-3级）实验室的，将标本送国家流感中心做病毒的分离工作。4国家流感中心实验室职责（1）国家流感中心设立在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感室；（2）对各省报告的禽流感疑似病例或确诊病例进行复核、确认；（3）对不具备禽流感病毒分离条件的省份送检标本的检测、分离和确认；（4）对需要做微量中和实验的血清标本进行微量中和试验；（5）对各省级实验室检测人员的培训；（6）对各省级流感实验室的质量控制。三、原始标本采集1标本采集人员医疗机构的医生、护士或当地疾病预防控制中心专业人员负责标本采集并填写标本登记表，标本采集人员按照禽流感职业暴露人员防护指导原则做好个

4、人防护。2标本采集种类和时限（1）采集标本的种类：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清以及死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物。（2） 采集标本时间：1）咽、鼻拭子或含漱液在发病的头3天采集；2）急性期血清在发病后7天内采集，恢复期血清在发病后2-4周采集；3）尸检标本尸检时采集。3标本的运送：所有采集的标本应在医院采集时立即分装，一式二份，其中一份单独保存，以备复核。采集的标本若不能在24小时内送达，则应尽快在70 以下保存。无70 条件的需在20 冰箱短时间暂存，并尽快联系递送标本。4标本采集的方法：详见国标流行性感冒诊断标准及处理原则四、送流感中心的标本包装、运送与接收1标本的包装（1）

5、标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧。（2）将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；每袋装一份标本。（3）直接在塑料管上用油性记号笔写明样本的种类、采样时间、编号、姓名，同时也将标本有关信息填在禽流感人体标本送检登记表，连同塑料管用另一塑料袋密封。（4）将装标本的密封袋放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密封。若将进行病毒分离，可将密封好的装有标本的容器直接放入液氮运输罐内运输。所有容器必须印有生物危险标识。2标本运送（1）航空或铁路运送。（2）专人专车运送：主

6、要用于近距离样品运送。3标本的接收（1）各省级中心实验室应公布标本接收联系方式，并实行24小时标本接收制；（2）国家实验室标本接收：需送国家流感中心实验室检测的原始标本、病毒分离物、可疑阳性标本、血清等，填写标本送检登记表，在低温保存条件下，于24小时内送至中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感中心进行复核。国家流感中心标本接收联系方式为：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，地址：北京市宣武区迎新街100号，联系人：郭元吉、王敏，联系电话：010-，010-，传真：（010）。五、标本检测方法1禽H5病毒核酸检测： 材料：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物

7、等。方法： RT-PCR，用于禽H5亚型流感病毒的快速检测、测序及排除工作试剂：特异性H5及甲型流感病毒的引物、病毒RNA 提取试剂盒、逆转录酶、Taq DNA聚合酶等试剂, 建议使用德国QIAGEN的Rneasy Mini Kit (病毒核酸提取 ) 和QIAquick Gel Extraction Kit（PCR产物纯化）产品。2病毒分离及鉴定：材料: 疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物等。方法：采用鸡胚和MDCK细胞分离方法，血凝及血凝抑制试验（HAI）具体方法详见国标流行性感冒诊断标准及处理原则。经特异性H5 RT-PCR病毒核酸检测阳性标本的病毒分离

8、及鉴定工作必须在安全级（BSL-3级）实验室里操作。试剂：鸡胚接种采用SPF鸡胚，MDCK细胞等。3疑似病例的血清学检测：材料：疑似病例的急性期和恢复期的双份血清方法：血凝抑制实验具体方法详见国标流行性感冒诊断标准及处理原则。试剂：H5灭活病毒。4微量中和试验材料：疑似病例的急性期和恢复期的双份血清试剂：H5活病毒，必须在生物安全级 (BSL-3级)实验室里操作。六、检测结果的确认以下情况的原始标本及分离物送国家流感中心检测、复核、确认。1标本分离物血凝试验（HA）阳性，同时H5血凝抑制试验（HI）阴性，H5的RT-PCR检测阳性。2标本分离物血凝试验（HA）阳性，同时H5血凝抑制试验（HI）

9、阳性或H5的RT-PCR检测阳性。3标本分离物血凝试验（HA）阳性，同时H5的RT-PCR检测阳性。4病人恢复期血清比急性期血清的H5抗体有4倍或以上增高。5标本分离物血凝试验（HA）阳性，H5血凝抑制试验阴性，并已排除了是当前流行的甲、乙型毒株的可能。七、检测结果报告一般情况下, 实验室收到的样本立即进行实验，并于收到标本后24小时内出具RT-PCR检测报告，3-5天出具病毒分离培养结果，于分离到病毒后的3-5天出具流感病毒的血凝抑制结果，微量中和实验须3-5天完成。当实验过程中出现不可预测情况或意外事件，影响了按时出具报告时，应及时报告和说明。附件ICS GB中华人民共和国国家标准GB流行

10、性感冒诊断标准及处理原则Diagnostic criteria and principles of management of influenza (报 批 稿)发布 实施国家质量技术监督局发布目次前言31 范围42 诊断原则43 诊断标准44 处理原则5附录A （规范附录） 病原学诊断方法5附录B（规范附录） 血清学诊断方法7附录C（资料附录） 红细胞凝集抑制试验8附录D（资料附录）神经氨酸酶活性抑制试验12附录E（资料附录） 对流免疫电泳及琼脂凝胶沉淀试验16附录F（资料附录） 流感快速诊断方法19GB前 言流行性感冒(简称流感)为一种人、禽、畜共患的病毒性急性传染病。流感病毒根据其核蛋白

11、（NP）和M1蛋白抗原性和基因特性的不同分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒常以流行形式出现，能引起世界性流感大流行，它在动物中广泛分布，并也能在动物中引起流感流行和造成大量动物死亡。乙型流感病毒能引起流感局部暴发，不会造成世界性流感大流行，至今除在人以外还能在海豹中分离到它。丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，它也能感染猪。流感常突然发生，迅速蔓延，波及面广，发病率和死亡率均高但病死率低。至今仍严重威胁着人的身心健康，甚至夺走性命，常给国民经济带来巨大损失，我国被世界公认为是流感的多发地。受卫生部传染病防治监督管理办公室委托，由郭元吉同志负责对流行性感冒诊断标准及

12、处理原则GB15944-1995进行修改，其目的：把过时的，不适用的删除，加入适用新的内容。具体修改之处如下：1前言中强调了流感为一种人、禽、畜共患病，同时考虑到禽流感病毒在人群中可引起的流感，其传播途径不清楚，故把传播途径删除。2诊断原则中增加了或从患者采集的标本中查到病毒颗粒特异的蛋白或特异核酸成分。3实验室诊断中去掉白细胞计数指标，因该指标不能做为流感的试验诊断依据。4附录A。病毒分离中，因甲型流感病毒“O”相特性的出现，故强调了细胞系统分离病毒的重要性；在HA测定中不应用鸡红细胞，而应用豚鼠或人的红细胞。5把B3神经氨酸酶抑制试验改为附录D。把B3中不规范的一律改为当今国际上统一使用的

13、方法。6删除B2已过时，操作复杂，易受实验条件影响的“型特异性补体结合试验，改为附录E“对流免疫电泳”，同时考虑到对禽血清抗体测定时，常用琼脂凝胶沉淀试验。因此，在附录E中也加入后者的内容。7快速诊断为附录C改为附录F。同时加入FLU OIA Kit 和RT-PCR法。本标准的附录A和B是规范的附录。本标准的附录C-F是资料的附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所本标准主要修订人：郭元吉本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释。中华人民共和国国家标准流行性感冒诊断标准及处理原则 GBDiagnostic crit

14、eria and principles of management of influenza1 范围本标准规定了流感的诊断标准及处理原则。本标准适用于各级医疗、卫生、保健机构和人员。对流感的诊断，报告和处理的应用。2 诊断原则流感流行时一般可根据临床症状，结合流行病学资料可对患者作出初步诊断。如确诊则需要病毒分离阳性或病人双份血清抗体测定，其恢复期抗体滴度较急性期增高4倍或以上，或从患者采集的标本中查到病毒粒特异的蛋白或特异核酸成分。3 诊断标准31流行病学资料在流行季节一个单位或地区同时出现大量上呼吸道感染病人；或近期内本地区或邻近地区上呼吸道感染病人明显增多；或医院门诊呼吸道感染病人明显增

15、多；或挨家挨户上呼吸道感染患者明显增多。32临床症状321 出现急起畏寒、高热、头痛、头晕、浑身酸痛、乏力等中毒症状。322 可伴有咽痛、干咳、流鼻涕等症状。323 少数病例有食欲减退、伴有腹痛，腹胀、呕吐和腹泻等消化道症状。 33实验室诊断331 从病人鼻咽分泌物中可分离到流感病毒（见附录A）。332 患者恢复期血清中抗流感病毒抗体滴度比急性期高4倍或以上（见附录B）。333 在患者呼吸道上皮细胞查到流感病毒颗粒特异的蛋白成份或特异的核酸（见附录F）。334 采集标本经敏感细胞将病毒增殖一代后，查到流感病毒粒特异的蛋白或特异的核酸（见附录F）。34病例分类341 疑似病例（流感样病例） 具备

16、腋下体温38，加上其他临床症状两项或以上，或加3、1及胃肠道症状两项或以上。342 确诊病例疑似病例加3.3.1或3.3.2或3.3.3或3.3.4。4. 处理原则4.1 早期隔离病人,服抗流感病毒药物,对症治疗和防并发症.早期发现病人,早期隔离(因地制宜,就地适当隔离)病人是重要的措施.对病人治疗一般采用对症疗法,发病早期(48小时内)可服用抗流感病毒药物,严重患者如严重肺炎,呼吸极度困难,高热不退等需住院治疗.防治并发症主要应防止流感病毒性肺炎和细菌性肺炎,尤其对年迈体衰者或伴有心血管,糖尿病,慢性呼吸道疾病者或婴幼儿等流感高危人群因他们由于流感本身或其它合并症可造成死亡,故应特别注意加强

17、治疗护理. 42 预防措施一般采用综合性措施，讲究卫生，注意体格锻炼和营养，保持室内空气流通；对易感人群应采取相对隔离措施，如避免接触病人，不去公共场所等；对年迈和健康状态差，尤其带有慢性病的人必要时可采用灭活疫苗接种，对疫苗过敏者或可能已被感染（如密切接触病人）者应及时服用抗流感病毒药物。 附录A（规范附录） 病原学诊断方法A1 病毒分离从疑似流感病人呼吸道采集标本分离病原体A2 标本的采集病毒分离成功与否很大程度上取决于采集标本的质量，时间（应于发病的头3天，越早越好），及其保存运输等环节。标本主要取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物，有时也采用肺活检材料等。常用的采样液为：普

18、通肉汤，pH 7.4-7.6的Hanks氏液或Eagle氏液或水解乳蛋白液。在采样液中需加入抗菌素，以往多用青、链霉素，近来发现不少种类细菌对它们具有耐药性，故近来多用庆大霉素（其终浓度为每ml采样液中加入0.1 ml的10mg/ ml）和抗真菌素（终浓度为每ml采样液中加入0.008 ml的250ug/ ml）。A21标本采集方法A 221 鼻拭子 将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入4-5 ml采样液的管中，尾部弃去。然后，塞紧或盖好管盖。A222咽拭子 用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将棉签头浸入4-5 ml采样液的管中，尾部弃去，塞紧

19、或盖好管盖。 注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作 量。A223鼻咽抽取物或抽取气管和支气管分泌物 用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从 气管抽取气管和支气管分泌物。先将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器3次。近来国内有用小孩导尿管接在50 ml注射器上来替代收集器。A224漱口液 用10 ml采样液漱口。漱时让患者头部微后仰，发噢声，让洗液在咽部转动。然后，用平皿或烧杯收集漱液。 注：取漱口液时，需预先了解患者是否对抗菌素有过敏史，如有，含漱液中不应含抗菌素。A225 肺活检材料肺活检组织在无菌

20、条件下，用灭菌过的乳钵磨碎，用生理盐水配成20%悬液，2000rpm离心10min，取上清加入上述提到的抗菌素。A3 标本运送标本应在4条件下，尽快送至实验室。标本至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，48h内能进行接种可置4保存，如未能接种应置-70下保存。A4 标本处理 标本至实验室后，含棉拭子的标本，先将棉拭子在管壁反复挤压后取出。然后用干净灭过菌的毛细吸管反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液。置4待其自然沉淀5-10min。注：如采样液中尚未加抗菌素应补加之，所加的量同前，加完并混匀，置4 1-2h后方可用于接种。A5 接种与培养最常用的为细胞接种和鸡胚接种法，有条件的应两法并用。近

21、来由于“O”相毒株的出现，MDCK（Madin Dardy Canine Kidney）等一些细胞对“O”相毒株的敏感性大大超出鸡胚的敏感性。同时“O”相毒株几乎不凝集鸡红细胞，故近来在红细胞凝集和凝集抑制试验中常用豚鼠或人的“O”型红细胞，而不用鸡的红细胞。A51 MDCK细胞接种和收获 成片的MDCK细胞弃生长液，用Hanks氏液洗两遍，将残余的牛血清洗净，每瓶加入接种标本0.5-1.0 ml，（接种量要根据瓶的大小），一般2瓶/标本，轻晃细胞瓶，使标本完全覆盖细胞，置35吸附1-2h；倒掉感染液，再用Hanks氏液洗1-2遍，每瓶加入3 ml（随瓶的大小而异）维持液（不含小牛血清，而含终

22、浓度为2ug/ml胰酶的Eagle氏溶液），置35培养；次日起每天观察有无细胞病理变化（CPE）；当CPE出现+ +号时，即75%-100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可将细胞冻融1-2次以提高收获标本的病毒滴度。由于CPE不能证实就是流感病毒所造成。最后还需检查维持液中是否有红细胞凝集活性（HA），用毛细吸管取细胞维持液3-4滴，放入血凝板孔中，而后加入等容量的1%豚鼠或人红细胞，轻摇混匀，置室温或4，1h后观察结果。出现红细胞凝集的为阳性标本，收获所有的维持液进行病毒鉴定。 如收获的维持液HA滴度不高或量不够用于鉴定，需在MDCK细胞中传代，把HA滴度提高或量增加后，方可进行病毒鉴定。

23、 如HA阴性，应在MDCK细胞上盲传一代，如HA仍阴性，可认为是阴性标本，弃之。注： CPE出现时间随感染病毒的型别，甚至毒株的差异以及感染量的大小而异。一般标本接种后7-10天还不出CPE，维持液中又查不出HA活性，基本上可认为阴性标本，弃之。同时要注意MDCK细胞的代数，因随MDCK细胞代数增加，其对流感病毒的敏感性下降。A52鸡胚接种和收获取9-11日胚龄鸡胚，经羊膜腔和尿囊腔接种标本0.2 ml，每份标本接种3-4只胚，置33-35培养72h。然后将鸡胚置4过夜（或置-20冰箱1h再置4数小时），分别收获尿囊液和羊水并检查HA活性（用毛细吸管分别取3-4滴尿囊液和羊水，分别置大孔塑料板

24、不同孔内，再加入3-4滴1 %豚鼠或人红细胞，摇匀后置室温或4 1h后观察结果。如HA为+ +时，再按系列倍比稀释测定HA滴度，如具有一定的HA滴度即可进行病毒鉴定。如HA阴性，可盲传一代，如HA仍为阴性则弃之。A6病毒鉴定至今对流感病毒鉴定最常用的方法为红细胞凝集抑制（HI）测定，因该法简便易行，结果可信（具体方法见附录C）。其次为神经氨酸酶活性抑制（NI）测定（具体方法见附录D）。进行型鉴定时常用对流免疫电泳（具体方法见附录E）。附录B（规范附录）血清学诊断方法B1 血清标本采集血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。急性期血样应尽早采集，一般不晚于发病后7天。恢复期血样则在发病后2-4周采

25、集。单份血清一般不能用作诊断。血液标本2000-2500rpm离心15min。收集血清，弃血凝块。B2 血清标本运送和保存血清标本在4下运送，置-20下长期保存。B3 抗体测定测定用抗原一般为当前人群中流行的H3N2 和H1N1亚型及乙型流感病毒。测定方法为HI法（见附录C）。B4 结果判断 凡恢复期血清抗体滴度比急性期增高4倍为阳性结果，其余的均为阴性结果。附录C（资料附录）红细胞凝集抑制试验C1原理流感病毒粒表面的血凝素（HA）蛋白，含有识别和结合宿主细胞表面受体的结构，能够与一些哺乳类动物和禽的红细胞发生凝集，这就是红细胞凝集现象。虽然多种哺乳动物和禽类的红细胞均能被流感病毒凝集，但目前

26、应用最广的是豚鼠、鸡和人“O”型的红细胞。“O”相毒株是指只能在鸡胚羊膜腔或敏感细胞中生长，感染的羊水或细胞维持液只凝集人或豚鼠的红细胞，而几乎不凝集鸡的红细胞的流感毒株。这种毒株在鸡胚尿囊腔适应传代后，获得了在鸡胚尿囊腔复制的能力，同时还获得了对鸡红细胞凝集能力与人及豚鼠的一样好，这种生物学特性发生改变的病毒为“D”相毒株。流感病毒能从凝集的红细胞表面释放下来，释放下来的病毒还能凝集新的红细胞，而被凝集和释放后的红细胞不能再被相同的病毒颗粒所凝集。于病毒悬液中加入特异性的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制红细胞凝集现象出现，即为红细胞凝集抑制实验。目前，红细胞凝集和凝集抑制实验为流感各方面工

27、作中应用最广泛的一种技术。C2实验器材C21 大孔或小孔塑料板C22 10ml或1ml 或1000ul和200ul或多排吸管C23 200ul和1000ul吸头C3试剂C31 0.85% 无菌生理盐水C32 Alsever氏液 葡萄糖 2.08g 柠檬酸钠 0.80 g 柠檬酸 0.055 g NaCl 0 .42g 加蒸馏水至 100ml 8磅20分钟高压灭菌，置4备用。C33 1% 红细胞悬液 以鸡红细胞为例：于10或20ml注射器中先吸入约3 ml 阿氏液（Alsevers Solution），然后从鸡翅静脉或心脏采集，用生理盐水洗涤3次，前2次1500r/ min离心5min，最后1次

28、同速度离心10min， 弃上清，用无菌生理盐水配成1%悬液，置4待用。一般置4能保存7天左右，一旦发生溶血应弃掉。C34受体破坏酶（RDE）C35 免疫血清或测定血清C4红细胞凝集实验C41 操作步骤C411 取一干净的大孔塑料板，标记所要测定的标本名称C412 于第一孔加入0.25ml（1：2开始稀释）或0.4ml（1：5开始稀释），从第二孔开始一律各加0.25ml 0.85%生理盐水。C413 如1：2开始稀释，于第一孔中加入0.25ml病毒悬液；如1：5开始稀释，于第一孔中加入0.1ml病毒悬液。用吸管吹打，使充分混匀，吸出0.25ml至第二孔，依次类推作倍比稀释，直至最后一孔，吹打后吸

29、出0.25ml弃掉。C414 于每孔中加入0.25ml 生理盐水，然后再加入0.25ml 1% 红细胞悬液。相混后置室温或4 30-60min，而后观察结果。 注：如采用微量法，应用小孔塑料板和稀释枪，总量为75ul（病毒25ul，25ul生理盐水和红细胞悬液25ul），其余同常量法。C42 观察结果 结果以+、+、+、+、和 表示之。 一层红细胞均匀地铺于孔上者为+。 基本同上，但边缘不整齐，铺的面积稍小些者为+。 红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为+。 红细胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝块者为+。 红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动象人的眼泪滴样者为 。但用豚鼠或人“O”型红细胞时常见不到孔底形成一个小团和眼泪滴样结果出现。 “”即为可疑，计算时以“”（阴性）处理。C43 红细胞凝集滴度计算 结果以+为终点，亦即一个凝集单位。也就是说最高稀释度病毒能引起+号的红细胞凝集为