肠杆菌科的鉴定.docx

1、肠杆菌科的鉴定肠杆菌科的鉴定1、标本要求： 1.1 尽量用药前采集标本。1.2 痰液：病人清晨咳痰于无菌、防漏小塑料盒内，切勿唾液送检。1.3 尿液：病人留取12h尿液，送检。1.4 粪便：病人留取粪便5 10g，送检。1.5 脑脊液及其它无菌体液：用无菌瓶直接送检。血标本不要冷冻。1.6 不可接受的标本：干的拭子、蜡盒、未消毒容器、留取24h后的尿或痰、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。2、仪器 35孵箱、普通光学显微镜3、试剂羊血平皿、麦康凯平皿、硝酸盐培养管、葡萄糖蛋白胨水、葡萄糖酸盐培养管、苯丙氨酸脱氨培养管、氨基酸脱羧培养管、拘橼酸盐培养管、尿素培养管、糖醇发酵管、湖南长沙天地人肠杆

2、菌鉴定板。4、试验方法及原理：4.1 硝酸盐还原试验： 方法：将待检菌接种硝酸盐培养基中，孵育过夜，加入等量A、B液13滴，观察结果。结果：红色为“+”，即还原硝酸盐。注意点： （1）培养基不应含亚硝酸盐，以避免假阳性。（2）某些肠杆菌还原硝酸盐的能力很强，还原硝酸盐为亚硝酸盐后，进一步将亚硝酸盐分解为氨、氮、氧化氮，造成假阴性。所以，观察结果时，如无红色出现，应加少量锌粉，仍无色，说明亚硝酸盐进一步分解，硝酸盐反应为阳性。若加锌粉后出现红色，说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而待检菌无还原硝酸盐的能力，即硝酸盐还原试验阴性。4.2 甲基红试验方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育过夜，加甲基

3、红试剂12滴，观察结果。 结果：红色为阳性，桔黄色为阴性。4.3 尿素培养基方法：将待检菌穿刺接种于尿素培养基中，孵育过夜，观察结果。结果： 培养基变红为尿素阳性，不变色为阴性。4.4 拘橼酸盐试验(Simmons法)方法：将待检菌接种于拘橼酸盐培养基中，孵育过夜，观察结果。结果：有细菌生长培养基变蓝色为阳性，无颜色改变为阴性。4.5 氨基酸脱羧试验方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养基和对照管中，封石腊油，35培养过夜，观察结果。结果：培养基变紫色为阳性，黄色为阴性。对照管应保持黄色。注意点： （1）培养基的pH值很重要。 （2）加封石腊油造成厌氧环境。因为在厌氧情况下氨基酸脱羧生成的胺才稳定

4、。 （3）对照管如不呈黄色，则氨基酸脱羧酶试验不能作出判定。4.6 葡萄糖酸盐试验方法：大量接种待检菌于葡萄糖酸盐培养基中，35孵育过夜或至48h，加班氏试剂，水浴中煮沸 lOmin观察结果。结果：有黄色到橙色出现为“+”，没有颜色变化为“一”。 4.7 糖、醇发酵试验方法：接种待检菌于糖醇发酵管，35孵育过夜，观察。结果：培养基变红色为阳性，不变色或黄色为阴性。4.8 苯丙氨酸脱氨试验方法：将待检菌接种于苯丙氨酸脱氨培养管，35孵育过夜，加三氯化铁试剂，观察结果。结果：培养基变绿色为阳性，不变色为阴性。5、常规鉴定过程：5.1染色与形态：肠杆菌科的细菌均为革兰阴性杆菌，其菌体大小为（1.06

5、.0）m（0.31.0）m。多数有周鞭毛，能运动，少数菌落如志贺菌属和克雷伯菌属无鞭毛，无运动能力。均不形成芽孢，少数菌属细菌可形成荚膜如鼠疫耶尔森菌、肺炎克雷伯菌及某些肠杆菌菌属的细菌。5.2培养特性：需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通琼脂培养基和麦康凯培养基上均能生长并形成中等大小的菌落，表面光滑，液体培养基中呈混浊生长。发酵葡萄糖产酸、产气，触酶阳性，除少数菌落外氧化酶阴性。可把硝酸盐还原为亚硝酸盐，但是欧文菌属和耶尔森菌属的某些菌株例外。具体见下表1：5.3鉴定要点及生化反应：1994年第9版伯杰鉴定细菌分册中肠杆菌包括24个与医学有关的菌属（见下表）。从临床标本中分离的频率较高的是

6、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌。西地西菌属（Cedecea）爱德华菌属（Edwardsiella）欧文菌属（Erwinia）枸橼酸杆菌属（Citrobacter）肠杆菌属（Enterobacter）埃希菌属（Escherichia）爱文菌属（Ewingella）哈夫尼亚菌属（Hafnia）克雷伯菌属（Klebsierlla）克卢瓦菌属（Kluyvera）勒米诺菌属（Leminorella）穆勒菌属（Moellerella）摩根菌属（Morganella）多源杆菌属（Pantoea）变形杆菌属（Proteus）普城菌属（Providencia，普罗威登斯）拉恩菌属（Rahnella）沙门

7、菌属（Salmonella）沙雷菌属（Serratia）志贺菌属（Shigella）塔特姆菌属（Tatumella）致病杆菌属（Xenorhabdus）耶尔森菌属（Yersinia）约克菌属（Yokenella）5.3.1 与其他科属细菌的鉴别 革兰阴性杆菌除了肠杆菌科外，还有弧菌科和非发酵菌。所以，肠杆菌科的鉴定首先应注意与这些菌的鉴别。可用形态、葡萄糖氧化或发酵、氧化酶、鞭毛等特性加以区别，见表2。 表1： 各种肠杆菌的培养特性比较菌名埃希菌属志贺菌属沙门菌属变形、普罗威登斯、摩根菌耶尔森（鼠疫）菌属枸橼酸杆菌属克雷伯菌属肠杆菌属沙雷菌属哈夫尼亚菌属培养特性营养要求不高，普通营养琼脂上生长

8、，麦康凯和SS琼脂中的胆盐对其有抑制作用。少数在血平板上可产生溶血环。普通琼脂和SS培养基上形成中等大小、半透明的光滑菌落，宋内形成扁平粗糙菌落在SS琼脂和麦康凯上可形成24mm的透明或半透明菌落，对胆盐耐受，产H2S可形成黑色中心。变形杆菌呈迁徙生长此现象可以被0.1石炭酸、4硼酸、56琼脂以及同型血清或胆盐所抑制。普通琼脂上形成透明浅灰色小菌落，在液体培养基中可形成沉淀和菌膜，底部絮状沉淀堆积呈“钟乳石”状。在血琼脂上形成灰色或白色，隆起、边缘整齐24mm不溶血的菌落，选择培养基上发酵乳糖。血琼脂上形成34mm圆形凸起灰白色，不溶血菌落，有时接种环挑取菌落时呈长丝状，发酵乳糖产酸。普通琼脂

9、形成大而湿润的黏液状菌落；血平板上不溶血；选择培养基发酵乳糖（聚团肠杆菌例外）。可在4氯化钠条件下生长；普通琼脂上呈白色、红色或粉红色菌落，可产生灵菌红素和吡羧酸。普通琼脂上易生长，兼性厌氧。表2； 肠杆菌科与其他科菌的区别 试 验肠杆菌科弧菌科非发酵菌葡萄糖FF0-氧化酶-+ *形态杆状弧形杆状鞭毛周毛或无单毛单、丛毛、周毛、无注：*，不动杆菌、嗜麦芽黄单胞菌除外。5.3.2 肠杆菌科的初步分群 可用两个试验将肠杆菌科初步分为三大类，即苯丙氨酸脱氨酶试验和葡萄糖酸盐试验(也可用V-P试验)，见表3:表3： 肠杆菌科初步分类菌 属 名苯丙氨酸葡萄糖酸盐菌 属 名苯丙氨酸葡萄糖酸盐变形杆菌属+-

10、埃希菌属-普罗威登斯菌属+-志贺菌属-摩根菌属+-沙门菌属-克雷伯菌属-+枸橼酸杆菌属-肠杆菌属- *+ *爱德华菌属-沙雷氏菌属-+耶尔森菌属-哈夫尼亚菌属-+注：有例外。5.3.3 苯丙氨酸阳性菌属及种的鉴别苯丙氨酸阳性、葡萄糖酸盐阴性的有变形杆菌属、普罗威登斯菌属、摩根菌属。5.3.3.1 各属的鉴别：变形杆菌属、普罗威登斯菌属、摩根菌属的区别可用H2S、鸟氨酸、枸椽酸盐三个试验，其鉴别见表4:表4： 苯丙氨酸阳性的各属鉴别试 验变形杆菌属普罗威登斯菌属摩根菌属H2S+-鸟氨酸+/-+枸椽酸盐+/-+-5.3.3.2 变形杆菌属种的鉴别：变形杆菌属常见有三个种即普通变形杆菌、奇异变形杆菌

11、、潘尼变形杆菌。产粘液变形杆菌仅从活的或死的吉普赛蛾幼虫中发现，与人类的关系未见报道。鉴别见表5。表5： 变形杆菌属内种的鉴别试 验普通变形杆菌奇异变形杆菌潘尼变形杆菌靛基质+-鸟氨酸-+-麦芽糖+-+ 5.3.3.3 普罗威登斯菌属种的鉴别：该属临床常见有3个菌种，即产碱普罗威登斯菌、斯图普罗威登斯菌、雷极普罗威登斯菌，其鉴别见表6:表6： 普罗威登斯菌属内种的鉴别试 验产碱普罗威登斯菌斯图普罗威登斯菌雷极普罗威登斯菌尿素-/+蕈糖-+-侧金盏花醇+-+5.3.3.4 摩根菌属的鉴定：摩根菌属常见1个种，即摩根摩根菌，其鉴定见”苯丙氨酸阳性的各属鉴别表”。5.4 苯丙氨酸阴性、葡萄糖酸盐阳性

12、各属及种鉴别5.4.1 葡萄糖酸盐阳性各属的鉴别：这类细菌有克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、哈夫尼亚菌属。可用动力、山梨醇、DNase、棉子糖等试验将其区别(见表7)。表7 葡萄糖酸盐阳性的各属的鉴别试 验克雷伯菌属肠杆菌属沙雷菌属哈夫尼亚菌属动力-+山梨醇+/-+-Dnase-+-棉子糖+/-枸橼酸盐利用+a+-鸟氨酸脱羧酶-d+b+c+注：a鼻硬结亚种、臭鼻亚种的某些菌株阴性。 b聚团肠杆菌阴性。 c芳香沙雷菌生物2群、普城沙雷菌、深红沙雷菌阴性。d解吗氨酸克雷伯菌阳性。5.4.2 克雷伯菌属种的鉴别：克雷伯菌属有肺炎克雷伯菌(亚种)、臭鼻亚种、鼻硬结亚种、产酸克雷伯菌。肺炎克雷伯菌和产酸

13、克雷伯菌是临床中分离较多的，二者的区别在靛基质。另外，两个亚种虽然临床不多见，但已从臭鼻患者、呼吸道慢性病患者以及鼻硬结患者中分离到，因此，鉴别它们也是有一定的临床意义。可用甲基红、赖氨酸、丙二酸盐鉴别(见表8)。表8 克雷伯菌属种的鉴别试 验产酸克雷伯菌肺炎克雷伯菌肺炎亚种臭鼻亚种鼻硬结亚种靛基质+-甲基红-+枸椽酸盐+-/+-赖氨酸+-/+-丙二酸盐+-+5.4.3 肠杆菌属种的鉴别：肠杆菌属常见有 5个菌种：阴沟肠杆菌、坂崎肠杆菌、聚团肠杆菌、产气肠杆菌、格高菲肠杆菌。在其鉴别上，氨基酸脱羧酶试验的价值较大。坂崎肠杆菌、聚团肠杆菌可产生黄色素，为鉴定提供了较为明显的特征。聚团肠杆菌还有一

14、个特点，就是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸皆为阴性。坂崎肠杆菌与阴沟肠杆菌的区别在于山梨醇，坂崎肠杆菌为阴性，阴沟肠杆菌为阳性。格高菲肠杆菌与产气肠杆菌也很相似，可用尿素酶和山梨醇相区别。前者尿素酶阳性，山梨醇阴性；后者尿素酶阴性，山梨醇阳性。5个种的鉴别详见表9。5.4.4 沙雷菌属种与哈夫尼亚菌属种的鉴别：沙雷菌属有8个种，但临床只有粘质沙雷菌相对较多见，可用阿拉伯糖、木糖与其他沙雷菌相鉴别(见表10)表9 肠杆菌属种的鉴别试 验阴沟肠杆菌坂崎肠杆菌聚团肠杆菌产气肠杆菌格高菲肠杆菌赖氨酸-+鸟氨酸+-+精氨酸+-山梨醇+-/+-尿素酶+/-/+-+黄色素-+-表10： 粘质、液化沙雷菌的鉴别试 验

15、 粘质沙雷菌液化沙雷菌红色沙雷菌阿拉伯糖-+棉子糖-+/-+木 糖-+鸟氨酸+-哈夫尼亚菌属只有1个种，即蜂房哈夫尼亚菌，其特点是不分解乳糖(偶也有分解的，约5)，发酵葡萄糖产气，动力“+”，靛基质“一”，VP“+”，枸橼酸盐“+”，H：S“一”，赖氨酸“十”，鸟氨酸“十”，山梨醇“一”，棉子糖“一”。该菌种的生化反应在25比较稳定，与其他菌属的区别见前表5322。5.5 苯丙氨酸、葡萄糖酸盐阴性的各属及种的鉴别5.5.1 这一类菌属有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、爱德华菌属、耶尔森菌属。他们的区别可用H2S、动力、枸橼酸盐、靛基质、赖氨酸、尿素6个试验相鉴别(见表11)。表11

16、 苯丙氨酸、葡萄糖酸阴性各属的鉴别试 验埃希菌属志贺菌属沙门菌属枸橼酸杆菌属爱德华菌属耶尔森菌属H2S-+/-+/-+-动力+-+- *枸橼酸盐-+/-+-靛基质+-/+-/+-/+赖氨酸+/-+-+/-尿素-+/-+/-注：30以下培养有动力。5.5.2爱德华菌属，虽有3个种，但只有迟缓爱德华菌具有临床意义。其特点是不分解乳糖，分解葡萄糖产气，产生H2S，动力“+”，靛基质“+”，V-P“-”，枸橼酸盐“-”，赖氨酸“+”，鸟氨酸“+”，其他糖和醇皆“-”。与其他菌属的区别见表11。5.5.3枸橼酸杆菌属种的鉴别：该属常见有弗劳地枸橼酸杆菌、异型枸橼酸杆菌、丙二酸盐阴性枸橼酸杆菌等。三者的鉴

17、别用靛基质、 H2S、侧金盏花醇(见表12)。5.5.4 埃希菌属从临床标本中常分离的是大肠埃希菌，靛基质“+”，甲基红“+”，枸橼酸“-”，但某些菌株动力“-”，迟缓发酵或禾发酵乳糖。不产气的菌株与志贺菌属的区别见表13。出血性腹泻的大肠埃希菌，其中最常见的为157：H7型，研究也较清楚。该菌种对山梨醇不分解(352448h)。最后用血清学诊断方法确定。表12 枸橼酸杆菌属种的鉴别试 验弗劳地枸橼酸杆菌异型枸橼酸杆菌丙二酸盐阴性枸橼酸杆菌H2S+/-靛基质-+-侧金盏花醇-+-丙二酸盐-/+-KCN生长+-+表13 埃希菌种与其他菌种的鉴别试 验蟑螂埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌(代谢不活泼菌株

18、)费格森埃希菌赫尔埃希菌创伤埃希菌宋内志贺菌其他志贺菌聚团肠杆菌迟缓爱德华菌不脱羧莱克勒菌靛基质-+-d-+V-P-d-枸橼酸盐d-d-硫化氢-+-尿素水解-赖氨酸+d+-+-+-鸟氨酸+d-+-+-+-动 力-+-+-+氰化钾生长-+-d-+丙二酸盐+-d-+-d-+葡萄糖产气+-+-+侧金盏花醇-+-+纤维二糖-+-d-+乳 糖-+-d-d-+甘露醇-+-+蜜二糖-+d-+-dd-+鼠李糖+d+-+-+山梨醇-+-dd-木 糖+d+-+-+粘酸盐d+d-+-d-d醋酸盐-+d+d-d-黄色色素-+d-+-y注：-，010阳性；-，1125阳性；d，2675阳性；+，7689阳性； +，90

19、100阳性；-Y，1125产黄色素。5.5.5 志贺菌属的鉴定：志贺菌属有4个种，临床上一般用抗血清鉴定血清群、型。在用诊断血清鉴定之前，必须确定属。有些大肠埃希菌生化特性不活泼，易与志贺菌混淆，根据表13所列的生化学特性鉴别。4种志贺菌血清分群方法见有关产品说明。5.5.6 沙门菌的鉴定：根据Bergeys鉴定细菌学手册第九版(1994年)登载，沙门菌属分邦戈尔沙门菌(Salmonella bongori)和猪霍乱沙门菌(Scho1eraesuis)。所有沙门菌属 (包括亚利桑那菌)血清型皆属上述二个种。邦戈尔沙门菌不到10个血清型，极其少见，而猪霍乱沙门菌有2 500以上血清型。猪霍乱沙门

20、菌再分6个亚种：亚利桑那亚种(subsparizonae)，猪霍乱亚种(subsp. choleraesuis)，双相亚利桑那亚种(subsp.diarizonae)，豪顿亚种(subsp. houtenae)，印第卡亚种(subsp. indica)，和萨拉姆亚种(subspsalamae)。属于猪霍乱沙门菌猪霍乱亚种的血清型皆已被命名，而其他亚种血清型没有命名。其鉴别见表5335。沙门菌的鉴定以抗血清凝集方法最方便。在凝集前必须确定属。与本菌相似的有枸橼酸杆菌和爱德华菌，可利用赖氨酸、靛基质、枸橼酸盐等试验进行区别。鉴别方法参见表14。表14 沙门菌种、亚种、血清型的鉴别试 验邦戈尔沙门菌

21、猪霍乱沙门菌猪霍乱沙门菌猪霍乱亚种亚利桑那亚种猪霍乱亚种双相亚利桑那亚种豪顿亚种印第卡亚种萨拉姆亚种猪霍乱血清型鸡沙门菌血清型副伤寒甲血清型雏白痢血清型伤寒血清型枸橼酸盐+-硫化氢+d+-+赖氨酸+-+鸟氨酸+-+-动 力+-+-+氰化钾生长+-+-丙二酸盐-+-+-+-葡萄糖产气+-+-阿拉伯糖+-+-卫矛醇+-+-d+-+-乳 糖-+-麦芽糖+-+密二糖+-d-+-+鼠李糖+-+-山梨醇+-+-+-+蕈 糖+-d+试 验邦戈尔沙门菌猪霍乱沙门菌猪霍乱沙门菌猪霍乱亚种亚利桑那亚种猪霍乱亚种双相亚利桑那亚种豪顿亚种印第卡亚种萨拉姆亚种猪霍乱血清型鸡沙门菌血清型亚利桑那亚种雏白痢血清型伤寒血清型

22、木 糖+d-+粘酸盐+d-+-d-酒石酸盐-+-d+d+-+半乳糖苷酶+-+-d-注：-，010；-，1125阳性；d，2675阳性；+，7689阳性；+，90100阳性。沙门菌分型血清种类较多，依血清可将沙门菌分成2500个血清型。具体做法参见有关说明。5.5.7 耶尔森菌的鉴定：耶尔森菌属中只有小肠结肠炎耶尔森菌较为常见。该菌与其他相应的菌属鉴定要点有二：尿素酶阳性； 37动力阴性，300以下培养动力阳性。借此可以与其他的肠杆菌科细菌相区别。耶尔森菌属种间鉴别见表15。表15 耶尔森菌属间鉴别表生化反应鼠疫假结核小肠结肠弗氏中间克氏奥氏伯氏莫氏罗氏吲哚-d+D-鸟氨酸-+25动力-+NA糖类发酵蔗糖-+-+鼠李糖-+-+-+-纤维二糖-+-+山梨醇-+蜜二糖-+-+-d6.临床意义：6.1 大肠埃希菌属：6.1.1肠道外感染：大肠埃希菌是临床分离的革兰阴性杆菌中最常见的菌种，可引起各种类型的感染，常引起人类泌尿系统感染；此外本菌还可引起菌血症、胆囊炎、肺炎级及新生儿脑膜炎等。常见于腹腔内脓肿、肠穿孔继发腹膜炎、肠道手术后继发感染或大面积灼伤创面感染。有时与类杆菌、粪肠球菌混合感染。产生的脓液粘稠，有粪臭味。本菌对一般的抗生素敏感，但易产生超广谱内酰胺酶（ESBL），而导致对第三代头孢菌素耐药。 6.1.2 肠道内