浙江万里学院基因工程期末复习考点.docx

1、浙江万里学院基因工程期末复习考点浙江万里学院基因工程期末复习考点第一章 绪论1.分子生物学与基因工程发展的代表性事件：（客观题）1928年，Griffith实验肺炎双球菌体内转化实验，证明了转化因子（DNA）是遗传物质，没有得出蛋白质与遗传物质的关系1944年，Avery实验体外转化实验，证实了蛋白质不是遗传物质。1952年，Hershey-Chase实验利用放射性同位素标记大肠杆菌T2噬菌体的捣碎实验证明了遗传物质是DNA，而不是蛋白质。1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代。威尔金斯 富兰克林（填空）1958年，Matthew MeselsonFrankli

2、n Stahl 采用氯化铯密度梯度离心法验证DNA 复制的半保留复制Marshall W. NirenbergHar G. KhoranaRobert W. Holley 1965年破译了所有氨基酸的密码子2.镰刀型贫血：氨基酸突变血红蛋白亚基N端的第六个氨基酸残基是缬氨酸（val），而不是下正常的谷氨酸残基(Glu)。3.胰岛素（公司+事件）1921年，加拿大科学家Banting和Best发现胰岛素, 是糖尿病治疗史上的里程碑1922 年，开始用于糖尿病的治疗胰岛素发现四人组”： Banting、Best 、科利普和麦克莱德1922年5月，多伦多大学与礼来公司(EliLilly and Co

3、mpany)达成协议，由科学家们帮助礼来开展胰岛素的规模生产。因苏林：第一支商业化胰岛素的诞生1982年5月14日，礼来向美国FDA提交了生物合成人胰岛素NDA18-790的申请1982年10月28日，FDA发布了批准书，第一支基因重组人胰岛素正式上市1997年，第一支基因重组人胰岛素进入中国Sanger测序法：蛋白质的结构和功能是由氨基酸序列所决定的中国科学家的贡献：人工合成牛胰岛素1973年，斯坦福大学的Stanley Cohen和加州大学旧金山分校的Herbert Boyer合作发表了一篇学术论文重组DNA技术4.1990年， 美国批准了第一例临床基因治疗申请，患者为四岁女孩Ashant

4、i de Silva，由于缺乏腺苷脱氢酶ADA基因而患有严重综合性免疫缺陷症，研究者W.F. Anderson将ADA基因导入患者的淋巴细胞，然后将经改造的淋巴细胞回输到患者体内，取得了成功。5.HIV被治愈唯一成功的例子：柏林病人6.基因编辑技术：ZFN锌指核糖核酸酶、TALEN转录激活因子样效应物核酸酶、CRISPR/Cas9第二章 基因操作的工具酶1.限制性核酸内切酶的作用：能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（分子手术刀）2.细菌细胞内特异性降解外源核酸分子的核酸酶，其作用特点

5、是：（知道）特异性降解异源DNA分子(甲基化修饰差异)I类限制酶随机切割双链DNA分子，II类限制酶识别、切割特殊的回文(对称)序列3.核酸工具酶分类：核酸水解酶类：核酸内切酶、核酸外切酶（填空） 核酸合成酶类：DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA连接酶核酸修饰酶类：甲基化酶、核苷酸激酶、核苷酸转移酶、磷酸酶4. 常用的工具酶（客观）工具酶类功能限制性核酸内切酶特异性识别和切割DNAT4DNA连接酶生成3- 5磷酸二酯键DNA聚合酶（Klenow片段）探针标记、补平3末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记末端脱氧核苷酰转移酶3末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基Taq DNA聚合

6、酶DNA合成、PCR5.载体的3个特点（功能元件）6. 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断7. 分子剪刀限制性内切酶分布：主要在微生物中作用特点：专一性: 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子多样性: 限制酶有200多种 结果：产生黏性末端或平末端（填空）8.判断粘性还是平末端9. 限制性内切核酸酶和甲基化酶一起称为限制修饰系统10. 内切核酸酶分为三类：即I型、II型、III型酶，通常所用的限制性内切核酸酶是指II型11. 采用Smith和Athens提议的方案，根据限制性内切核酸酶来源和菌株命名（选择判断）a)

7、 用来源细菌的英文缩写斜体符号命名b) 它的第一个字母大写，来源细菌属名的第1个字母c) 第二、三字母小写，来源细菌种名的头2个字母d) 第四个字母代表菌株e) 最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号Eg. Hind 代表从流感噬血杆菌（Haemophilus influenzac）d株中分离到的第3个限制酶12. 不同限制性内切酶切割的三种结果: （填空）a. 产生5突出粘性末端cohesive end（EcoR I）b. 产生3突出粘性末端（Pst I、Bam H）c. 产生平末端blunt end（Nru I）13. 同尾酶（判断题）BamH I和Bgl II，Sal I和Xho

8、I14. 限制性内切核酸酶HpaII和MspI是同位酶，切割同样的DNA序列CCGG，但对这个序列的甲基化状态有不同的限制性反应 MspI切割所有状态下的CCGG序列，而HpaII仅切割非甲基化的CCGG序列。这样MspI被用来识别所有的CCGG序列，而HpaII能用来确定是否甲基化15.影响内切酶酶切反应的条件（简答，如何调整） 温度：一般37 盐离子浓度：Na，Mg2 缓冲体系：具有稳定pH环境的Tris-HCl缓冲体系，DTT用于保持酶稳定性和活性 反应体积和甘油浓度：商品化的限制性内切核酸酶均加50甘油作为保护剂，一般在-20保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10，否则甘油

9、浓度过高，影响酶切反应 反应时间：通常为1h；（不超过4h，否则产生非特异性结合，HF-高保真酶）进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜 DNA纯度和结构：一个酶单位定义：1h内完全酶解1g噬菌体DNA所需的酶量 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、 RNA等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度；酶切的底物一般为双链DNA，DNA的甲基化位置（用甲基化酶切割）会影响酶切反应 评估DNA是否满足酶切条件：跑胶看下面有没有亮条带酶切反应注意事项：价格昂贵；决不能用水稀释，以免变性失活；预先加入除酶以外的所有其他试剂；取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融；使用无菌的新吸头；少加水,使体积最小,但保证

10、酶液体积不超过总体积的10,否则酶液中的甘油会抑制酶活性16. “星”活性产生非特异性切割17. DNA连接酶：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3羟基和5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板），使断开的DNA 裂口连接起来（填空）结果：使粘性末端（平末端）连接起来，粘性末端效率高（判断题）18. DNA连接酶的作用过程（简答）1) 连接酶与辅助因子ATP或NAD形成酶-AMP复合物2) AMP作用于DNA缺口的5-末端磷酸基团3) 缺口3-OH对活跃的磷原子作亲核攻击，形成新的磷酸二酯键，封闭切口19. DNA连接酶的反应条件连接反应的温度是影响转化效率

11、的最重要参数。多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15以下，然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是37但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷，所以连接反应一般采用16过夜20.平末端DNA片段的连接（了解，客观）a) 直接用T4 DNA连接酶连接：效率不高，较少采用b) 同聚物连接平末端DNA片段：先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA连接酶进行连接c) 用衔接物连接平末端DNA分子：目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接21. 重组DNA

12、实验的一般程序（掌握）1) 选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶（如EcoR I）作位点特异的切割，形成全长的具粘性末端的线性DNA分子2) 再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化3) 混合，加入DNA连接酶。由于具有相同的（如EcoR I）粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经DNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA分子22. 碱性磷酸酶（修饰酶）：预先处理质粒载体，防止环化（知道）功能：催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5 端磷酸基团, 从DNA片段上除去5磷酸以防自身连接用途：在用-P32磷酸和多核苷酸激酶在5端标记DNA或RNA之前，进行碱性磷酸

13、酶处理；在DNA连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接。23. 磷酸激酶（了解）对核酸末端羟基进行磷酸化的酶，用途：放射性标记DNA链的5末端，探针标记；Maxam-Gilbert化学法的DNA序列分析；使缺少5磷酸的DNA片段和合成接头磷酸化特性：该酶很难纯化,酶制品经常不纯；铵离子是该酶的强烈抑制剂；低浓度的磷酸也可抑制该酶活性24. 末端脱氧核苷酸转移酶（了解用途）来源：小牛胸腺 功能：在一定条件下，催化将一个一个的脱氧核苷酸，沿着53加到DNA链的3-OH末端。该过程不需要DNA模板，对双链、单链DNA都适用。经常用于人工粘性末端的构建25.甲基化酶（了解）甲基化：能识别限制酶识

14、别的序列，识别顺序中的某个碱基发生甲基化（常见使限制酶识别序列中的C或A甲基化修饰），属修饰酶类。经修饰的DNA不再被限制酶降解 细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶（methylase）来完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序 真核生物中目前只发现5甲基胞嘧啶(M5C)第3章 载体1. 载体：携带目的基因进入宿主细胞进行复制、扩增和表达的工具称载体(Vector);即用于克隆、运载和转移目的基因并能自我复制的DNA分子。2. 质粒：是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。3. 噬菌体载体：为线性双链DNA分子，全长48.5

15、kb， DNA两端各有一个互补单链的粘性末端，能通过碱基互补作用形成环状DNA分子。粘性末端形成的双链区域称为cos位点，它是包装蛋白的识别位点。4. 粘粒：又叫柯斯质粒(Cosmid)载体，是指带有粘性末端位点的质粒。它是一种由人工构建的含有噬菌体DNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的杂和质粒载体，在结构组成上具有噬菌体的特性，也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力，一般可插入3540kb的外源基因。是构建真核生物基因文库的主要载体5. 人工染色体载体：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。主要有酵母人工染色体(YAC)及细菌人工染色体(BAC)。6. 细菌人工染色体(BA

16、C)：是基于大肠杆菌的F质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。7. 酵母人工染色体(YAC)：载体是利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体。是最早构建成功的人工染色体克隆载体。8. 报告基因：在转基因的研究中，常常在载体上重组选择标记基因，通常称为报告基因，在一定的选择压力情况下，利用报告基因在宿主细胞内的表达，达到筛选转化子的目的。9. 载体按作用分类：克隆载体，表达载体，穿梭载体。10. 各种DNA载体比较（掌握）类型最大插入尺寸(kb)应用局限性质粒6-12DNA克隆、亚克隆，表达限制插入片段、蛋白表达，复制收到限制黏粒35cDNA和基因组文库蛋白表达不理想，噬菌体填充受限，哺乳动物细胞不能复

17、制细菌人工染色体(BAC)300基因组文库，大片段DNA细菌复制收到限制，不能用于蛋白质的表达酵母人工染色体(YAC)200-2000基因组文库，大片段DNA必须在酵母中生长Ti质粒各种类型植物中基因的转移只能在植物细胞中，限制性位点随机分布，尺寸大难以操作11. 质粒载体的修饰改造（了解）：去掉不必要的DNA区域, 只保留质粒复制必须部分，以提高外源DNA装载量减少质粒内限制性内切酶位点，质粒酶切位点过多，给克隆外源DNA造成不便加入选择性标记：通过质粒间的重组使质粒携带合适标记，常用的有抗生素抗性标记。如：氨苄青霉素抗性标记、四环素抗性标记、卡那霉素抗性标记等安全性能改造：不能随便转移，以

18、免污染环境改造或增加基因表达的调控序列：比如加入强启动子12. 发展概况（看一下即可）第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体13. pBR322分子量小（4.3kb）、拷贝数高、含四环素和氨苄青霉素两种抗生素抗性基因作为选择标记、对多种常见的限制性内切核酸酶仅有一个切割位点。14. pUC载

19、体的三个显著特点：（1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ，可利用-互补原理进行蓝白筛选（3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。 15. 蓝白斑筛选原理：pUC18/pUC19上含有一个LacZ基因的调控序列和编码-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的序列（-互补肽）的DNA序列（标记为lacZ），多克隆位点就存在于lacZ上，-半乳糖苷酶

20、的C端编码基因却位于相应的宿主菌上。当这两个部分基因产物（缺陷型 -半乳糖苷酶）结合才会形成一个有活性的-半乳糖苷酶。（这种机制称为-互补作用）X-gal作为-半乳糖苷酶的指示剂。在诱导物IPTG存在下，-半乳糖苷酶催化 X-gal形成蓝色化合物，导致菌落呈现蓝色。在多克隆位点中插入外源DNA，打断-半乳糖苷酶的部分基因，不再产生-肽链，就不能和宿主细胞产生的多肽片段结合生成有活性的-半乳糖苷酶，结果X-gal保持无色，菌落呈白色。16. 噬菌体载体：噬菌体可以容纳较大的目的基因。例如用置换法可去掉长达20kb的DNA，换入相应长度的目的基因。基因文库构建常使用载体。17. 噬菌体入侵E.co

21、li后，可选择进入裂解生长状态（烈性噬菌体）或溶源状态（温和噬菌体）。在进入溶源状态时，环状的噬菌体基因组DNA与宿主DNA在附着位点上发生联会、断开、交换并重新组合，整个DNA整合到宿主的染色体DNA上成为原噬菌体。这种情况下，只有c基因得以编码表达阻遏蛋白，其可以使参与溶菌周期活动的所有基因失去活性。故不会繁殖裂解细菌。18. 噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程，诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导:在低温时（30）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解，这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关。19. DNA载体的构建： 1.缩短长度；2.删除重复的酶切口；3.加装选择标记。20.

22、 噬菌体载体分类：插入型载体：仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点，如gt系列。替换型载体：具有两个对应的酶切克隆位点，如Charon4、EMBL4、EMBL3。21. 表达载体特点：具有克隆载体所具有的基本特性；具有可被宿主细胞识别的基因表达调控元件：启动子，核糖体结合位点，转录终止序列。22. 原核生物表达载体三个重要原件：复制原点、多克隆位点、终止子。23. 启动子：大肠杆菌表达载体中常用的启动子：（1）trp-lac启动子（又称tac启动子） tac启动子是一种人工构建的双杂合启动子，由trp启动子、lac操纵子的操纵基因和SD序列融合而成。受lac阻遏蛋白的抑制，异丙基硫代半乳糖苷的

23、诱导表达。（2） 噬菌体PL启动子 特点：受温度的控制，低温（37）下被阻遏而抑制，高温（42）下去阻遏而激活（3）T7噬菌体启动子24. SD序列称为核糖体结合位点。25. 高效表达策略：SD序列域密码子的距离原核序列融合表达（密码子优化）减轻宿主代谢负担：生长于表达阶段分开，蛋白分泌26. 原核表达系统：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。27. 穿梭载体：能在两种不同的生物中复制的载体，能在原核和真核生物中复制。（通常穿梭载体在细菌中用于克隆和扩增克隆基因，在真核细胞中用于基因表达分析）28. 真核表达载体启动子：诱导型：AOX：醇氧化酶（最强启动子）MOX：醇氧化酶PHO: 温度诱导 （23度表

24、达）GAL （半乳糖诱导）组成型：GAP（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）TEF1（延长因子）ADH（乙醇脱氢酶）29. 酵母表达系统：酿酒酵母，甲醇酵母，克鲁维酵母，汉逊酵母30. 酿酒酵母：1 安全性2 遗传背景清楚3 DNA导入方便4 易于高密度发酵5 翻译后修饰甲醇毕赤酵母：1 生长迅速2 pAOX1强启动子3 可诱导表达31. 分泌信号肽：MF-a ：性结合因子，含88个氨基酸，效率高。PHO5：酸性磷酸酯酶SUC2：蔗糖酶KIL：杀手毒素因子保守性低，通常不能再宿主间通用32. 翻译后糖基化修饰：Asn-X-Ser/ThrN-糖基化：天门冬酰胺上的酰胺氮进行糖基化O-糖基化：苏/丝氨酸上的

25、羟基氧进行糖基化（甘露糖）33. his4-、Mut+：his4-：组氨酸缺陷型；Mut+：有pAOX I，pAOX II启动子；Mut-：无pAOX I，pAOX II启动子；Mut s：只有pAOX II启动子。34. 重组方式：整合方式1：插入。如AOX位点、His4位点插入；整合方式2：发生多次重组；整合方式3：替换。35. 真核表达策略提高转录水平（启动子）；信号肽；基因剂量（基因拷贝数）；整合位点；发酵条件（培养基成分、pH、溶氧、消泡等）；表达产物的稳定性（蛋白酶缺陷菌株、降低pH、竞争性抑制）。36. 昆虫植物等表达载体（了解）自己了解一下PPT，内容太多就不详细列出，看着心烦

26、。Ti质粒：Ti质粒具有五个主要功能区域: T-DNA、质粒转移、冠瘿碱代谢(opine catabolism)、复制原点(ori)和毒性区域(vir)。T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA两端与其它序列交界处的25bp不完全直接重复，右端的序列称为右界(RB), 左端的为左界(LB)。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失后，将其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的。第四章 分子克隆1 分子克隆的路线1. 获取外源DNA片段2. 外源DNA与载体连接3

27、. 重组载体导入寄主细胞4. 选择与鉴定克隆重组子早期基因分离方法中利用理化方法分离基因：密度梯度超速离心法 （了解）2 逆转录法的过程（知道）分离和纯化目的基因mRNA，反转录成cDNA，其程序:总RNA的提取：选择富含某种特异mRNA的组织细胞 a. 细胞内RNA的组成和含量:DNA95%核内5细胞器RNA10%核内15%细胞器75细胞质80-85%rRNA10-15%tRNA1-5%mRNAb. 真核细胞mRNA的特点及分离纯化方法 3端具多聚A尾端序列,可利用多聚T为引物与其配对mRNA的分离与纯化 a. poly(A)RNA的分离：柱层析 b. mRNA的分级：密度梯度离心或电泳 m

28、RNA转译活性的鉴定：通过转译系统检测基因产物逆转录合成双链cDNAcDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使寡聚(dT)选出的mRNA有530%被拷贝cDNA第二链的合成 cDNA克隆, 将重组体导入细菌细胞注：没有多聚A尾端序列的RNA分子，可用寡聚六苷酸（hexamer）为引物合成第一条链3 文库构建（知道）基因组文库的构建1.供体生物基因组DNA的制备,尽量提取大分子量的比较纯合的基因组DNA2.限制性核酸内切酶部分酶切后，分离选择具有一定长度（15-20kb）的DNA片段3.在体外将代表该生物完整基因组的所有DNA片段与合适的载体连接成重组分子4.根据所用载体，选择相应的宿主细胞（

29、大肠杆菌）5.导入受体细胞噬菌体加BamHI人工接头转导克隆cDNA文库构建1.分离细胞总RNA，然后利用真核mRNA分子的3端多聚A结构将mRNA从tRNA和rRNA中分离出来2.以mRNA为模板逆转录合成cDNA第一条链3.合成cDNA第二条链有两种方法:一是用大肠杆菌的RNaseH切割RNA-DNA杂交分子产生RNA短片段，DNA聚合酶I以RNA短片段为引物合成新的DNA链;二是利用cDNA第一链的3端出现的发夹环结构，即第一链末端返折为合成cDNA第二条链提供引物 4.这些体外合成的cDNA经两端补齐后而具平头末端，在cDNA分子的两端与带有限制性核酸内切酶位点的人工接头连接，然后酶切

30、后与载体(通常是噬菌体)连接，导入大肠杆菌，即得cDNA文库（判断）理想的基因组文库应包括全部的基因组序列，每一个克隆包括的DNA片段越大，则总克隆数目就可以越少，因此，构建核基因库时常要选择能接受较大片段的载体检测构建的基因组文库是否包括一个完整的基因组序列，可用下面的公式计算：如人类基因组DNA全长为3.0x106kb,以EMBL作载体，插入片段的平均长度为17 kb，P为99%时构建的基因库应有8.1x105 个重组噬菌体4 热激转化法的影响因素：（客观题） 载体：载体性质、空间结构、分子大小等 受体细胞 转化过程5 电激转化法相比于热激转化法的优势操作简便、效率高适用于各种细胞可转移大于100Kb的质粒DNA6 基因枪转化技术（判断）基因枪技术, 又称为生物弹道技术或微粒轰击技术，是用火药爆炸或者高压气体加速将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒直接送入完整的组织或者细胞中的一种技术。其基本原理就是采用一种微粒加速装置,使裹着外源基因的微米级的金或钨颗粒获得足够的动量打入靶细胞或组织已广泛用于转化水稻、小麦、玉米、大豆等主要作物7 重组子直接筛选（了解）