淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术.docx

1、淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。一、细胞融合前准备(一)免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得

2、高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1100.5ml ip (腹腔内注射)23周后第二次免疫1100.5ml ip3周后加强免疫(融合前三天)1100.5ml ip或iv(静脉内注射)取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分

3、枝杆菌充分混匀。初次免疫 Ag150g加福氏完全佐剂皮下多点注射(一般0.81ml0.2ml点)3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip(ip剂量不宜超过0.5ml)3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip (57天后采血测其效价，检测免疫效果)23周后加强免疫，剂量50500g为宜，ip或iv3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。(二)

4、饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLbc小鼠610周龄拉颈处死浸泡于75酒精，消毒35分钟用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌注射器注入68ml培养液反复冲洗，吸出冲洗液放入10ml离心管，1200转分离心56分钟用20小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的

5、培养液混悬，调整细胞数110ml加入96孔板，100l孔放入37CO2孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得58106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5106ml，小鼠脾细胞为1106ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1105ml，均为100l孔。(三)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP20、X63 Ag8.653等。骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在1020，细胞的最大密度不得超

6、10ml，一般扩大培养以110稀释传代，每35天传代一次。细胞的倍增时间为1620小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每36月应用8AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95，也是决定细胞融合的关键。(四)免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出

7、脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的倍，细胞数为10左右。二、细胞融合，选择杂交瘤(一)细胞融合流程(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP20，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按110或15的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀

8、略加松动。(6)在室温下融合:30秒内加入预热的1ml45PEG(Merek,分子量4000)含5DMSO，边加边搅拌。作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。(7)离心，800rpm，6分钟。(8)弃上清，先用6ml左右20小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。(9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。(10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100l孔，37、5CO2孵箱培养。一般一块96孔板含

9、有1107脾细胞。(二)HAT选择杂交瘤应用HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50贮存，用时1ml加入50ml20小牛血清完全培养液中。因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200l孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的23进行选择，可得到满意的筛选结果。50HATH:510-3MA:210-5MT:810-4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养

10、液。三、抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底110面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有:1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。2.RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。3.FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。4.IFA用于细胞和病毒McAb的检测。上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程

11、。可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要

12、定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。(一)克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。1.有限稀释法的程序制备饲养细胞悬液(同融合前准备)阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1510ml取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞ml，100l孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个ml，100l孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个ml，100l孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。培养

13、45天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200l孔。第89天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。2.软琼脂法软琼脂的配制含20FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI16401琼脂水溶液：高压灭菌，42预热。0.5琼脂：由1份1琼脂加1份含20小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42保温。用上述0.5琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。按100ml，500ml或5000ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。1ml 0.5琼脂液(42预热)在室温中分别与1ml不同浓

14、度的细胞悬液相混合。混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37，5CO2孵箱中。45天后即可见针尖大小白色克隆，710天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。(二)杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环

15、境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。细胞冻存液:50小牛血清40不完全培养液10DMSO(二甲亚砜)冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0，再降温时一般按每分钟降温23，待降至-70可放入液氮中。或细胞管降至0 后放-70超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。五、单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为1060gml，

16、如果大量生产，费用较高。2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按13107ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml, 共24点。待肿瘤达到一定大小后(一般1020天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mgml。但采血量有限。腹水的制备常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLbc鼠，12周后腹腔注射1106个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集

17、数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml， 这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。六、单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:1.抗体特异性的鉴定：除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它

18、细胞因子间有无交叉。2.McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG(3)，将有利于沉淀线的形成。3.McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。4.McAb识别抗原表位的鉴定

19、：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。5.McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。七、影响因素、失败原因分析由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。其主要失败原因和影响因素有:1.污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代

20、培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALBc小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。2.融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素PEG有毒性或作用时间过长。牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。骨髓瘤细胞污染了支原体。HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

21、对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。三要:要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。要定期进行再克隆。三不要:不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。4.杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由

22、于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备 有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为/雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程

23、中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以23kg为宜。（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统

24、，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：29（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入120mg卡介苗就成为完全佐剂。配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗34mg/ml或不加），加完后

25、再继续研磨成乳剂，滴于冰水上510min内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。（四）免疫方法抗原剂量，首次剂量为300500g，加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。每23周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加强免疫时不必注射百日咳疫苗。在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取23ml血，制备血清，检测抗体效价（见后）。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止（图2-3）。当抗体效价达到预期水平时，

26、即可放血制备抗血清。图2-3 抗体反应（五）抗血清的采集与保存家兔是最常用以产生抗体的动物，因此这里主要讨论兔血的收集。羊等较大动物以颈静脉、动脉取血，鼠等小动物取血可参阅有关资料。取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也可心脏采血。取动脉或静脉放血时，将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集3040ml 。然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反复多次放血。颈动脉

27、放血时，将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.050.2ml），贮于-40以下冰箱，或冻干后贮存于4。C冰箱保存。（六）抗血清质量的评价在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。1效价 抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量

28、。效价测定的方法常用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。（1）放射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。通常以结合率为50%的血清稀度和为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血清的效价，除由抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间，所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起注意。（测定方法见第8章）（2）双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交

29、处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。球脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65左右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔（图2-4）。中央孔内加适量抗原（容量为50l），周围各孔内分别加入50l 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37下孵育24h，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度（图2-5）。图2-4 双向扩散模型图2-5 免疫扩散试验2特异性测定 抗血清的特异性或称专一性是指抗血清对相应的抗原及近似的抗原物质的识别能力。特异性好就是抗血清的识别能力强。通常，特异性是以交叉反应率来表