激素及激素代谢产物的测定.docx

1、激素及激素代谢产物的测定第十二章 激素及激素代谢产物的测定体液中激素及其代谢产物的浓度甚微，如血液中的浓度往往在每100ml只有数微克水平，24h尿液中的浓度也只有数微克至数毫克水平，因此要求具有极其灵敏而特异的方法才能进行测定。比色法灵敏度不够高，但由于操作简便，不需特殊设备，仍作为常规测定方法，如尿中17-酮类固醇、17-羟皮质类固醇的测定。荧光法的灵敏度较比色法高约100倍，尿儿茶酚胺的测定可采用此方法。放射免疫法因具有灵敏度高、特异性强等优点，几乎全部激素均可用这种方法进行测定。但由于放免法受放射性物质的限制，短半衰期的限制，125I标记物灵敏度的最低值限制等限制了这项技术的发展。于是

2、酶免疫测定法、化学发光免疫测定法、时间分辨荧光免疫测定法等得到了长足的发展，且已越来越多地应用于激素及其代谢产物的测定。实验71 ELISA法测定人绒毛膜促性腺激素 人胎盘绒毛滋养叶细胞合成与分泌的人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)是一种由和亚基构成的糖蛋白(分子量36 000)。其亚基的肽链组成与结构和来自脑垂体前叶的糖蛋白激素促黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)相类似。而绒毛膜促性腺激素亚基(-hCG)则具有特异性，系hCG的生物活性所在。故测定-hCG交叉反应小，特异性高，能准确地反映hCG的水平。 【原理

3、】 二点酶免疫分析法的原理是先将抗-hCG亚基单克隆抗体(McAb)包被固相载体(如聚苯乙烯反应板微孔)，再加入检样与酶标记的抗-hCG亚基McAb，如检样中有hCG存在，则可形成夹心式结合物，加入底物后出现呈色反应。因采用对hCG特异的抗-亚基McAb包被，故特异性较高。 【试剂】 酶免疫法测hCG试剂盒。最主要的试剂包括：1 包被固相载体用的-hCG亚基McAb。2 辣根过氧化物酶(HRP)标记的-hCG亚基的McAb。3在HRP反应体系中作底物(供氢体)的四甲基联苯胺(TMB，目测呈蓝色)或邻苯二胺(OPD，呈现黄色)。【操作步骤】 二点酶免疫法 1标本 (1) 尿液：以1 5002 0

4、00r/min离心10min。清晨尿hCG水平最高，接近于血清水平，通常收集晨尿送检。 (2) 血清：不加抗凝剂，尽快分离血清进行检测。 2在已包被抗-hCG亚基McAb的聚乙烯反应板微孔中加最适浓度(说明书指定)酶标记抗-hCG亚基McAb 0.1ml，立即加尿或血清0.1ml。 3轻轻抖动反应板，或于混匀器上混匀30s，再置37 20min。 4甩去孔内反应物，以蒸馏水冲洗6次，晾干。 5加底物溶液0.1ml，室温放置5min，观察。蓝色(底物为TMB-H2O2时)或黄色(底物为OPD-H2O2时)为阳性，无色为阴性。如需定量，可同时做一标准系列浓度，结果以lgC对吸光度作图，待测样本浓度

5、可从曲线中查出。 【参考范围】 正常人hCG1.0g/L。 【临床意义】 1可用于早孕诊断。正常育龄妇女hCG升高提示早孕。 2作为绒毛膜上皮细胞癌、葡萄胎的早期诊断指标。 3可用于对绒毛膜上皮细胞癌、葡萄胎手术后化疗效果观察，是有效随访监测的手段。 【评价】 早期采用的生物学方法由于所选择的试验测试对象的个体差异及对试验条件的反应性不同，使得定性测试结果差异较大。随后出现凝集抑制试验，在试验中引入凝集抑制试验及免疫学的技术，使得灵敏度、准确度、精密度有了一定的提高，检测时间进一步缩短(最快速检测35min完成定性)。通过对抗体的纯化标记技术的改进，引入了同位素标记及酶标记技术，极大地提高了检

6、测灵敏度、准确度、精密度，使hCG测定从定性转化为定量，极大地满足临床的需要。现今较常用对血清、尿液等的定量分析方法为竞争性结合的放射免疫法及固相双抗体夹心酶联免疫吸附试验，化学发光免疫分析也已应用于临床。(刘忠民) 实验72 酶标免疫荧光法测定血清皮质醇 皮质醇(Cortisol)又称氢化可的松、化合物F、糖皮质类固醇。血液中皮质醇浓度直接反映肾上腺糖皮质激素分泌情况，而尿中游离皮质醇(Urine free cortisol，UFC)由血液中游离皮质醇经肾小球滤过而来，因此其量与血浆中真正具生物活性(包括调节自身分泌)的游离皮质醇浓度成正比。血浆(清)皮质醇或24h UFC测定现被推荐为是否

7、存在肾上腺皮质功能紊乱的临床生化检查首选项目。目前皮质醇测定方法有荧光光度法、免疫化学法、HPLC、GC、GC-MS等。其中，荧光法因受多种内源性皮质激素及其前体物如皮质酮、11-去氧皮质醇(甲吡酮抑制试验时可能大量出现)等干扰，特异性较差，测定结果较其他方法偏高。HPLC、GC、GC-MS法虽然特异性、灵敏度均高，但难以在临床常规工作中使用。免疫化学法除特异性及灵敏度均可满足要求外，其操作简便、快速、且有商品试剂盒供选用，为目前最常使用的方法。【原理】 以皮质醇-C21-半琥珀酸在低温下进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，得到高活力的酶标记物。抗体包被于微孔滴定板上，采用竞争抑制原理进行反应，

8、后用对羟基苯丙酸(HPPA)作为荧光试剂，测定血中皮质醇，代替放射免疫中的同位素标记，从而建立酶标免疫荧光测定法(F-EIA)。【试剂】1辣根过氧化物酶(HRP)。2对羟基苯丙酸(HPPA)。3皮质醇抗体。4皮质醇-C21-半琥珀酸。5包被缓冲液 0.05mol/L NaHCO3-Na2CO3(pH9.6)。6测定缓冲液 0.12mol/L PBS(pH7.07.2)。7洗涤缓冲液(PBST，pH7.07.2)，每1 000ml PBS中加0.5ml Tween-20。8荧光试剂 Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)；0.5% HPPA和0.05% H2O2，临用前以1:1(V/V)新鲜配

9、制。9终止液 2mol/L NaOH。【测定】1抗原的酶标记 采用混合酸酐法。取皮质醇-C21-半琥珀酸3.1mg，二氧六环0.2ml，三正丁胺10l，氯钾酸异丁酯4l，在4反应30min，滴加入HRP 7.1mg/ml中，整个溶液保持在pH88.5，水浴反应4h，测定缓冲液透析48h，用Sephadex G50柱层析(50cm1.5cm)，洗脱液为0.05mol/L PBS(pH77.2)，用部分收集仪收集每管1ml，共30管，用分光光度计405nm波长测吸光度，取高值管加0.2%牛血清白蛋白(BSA)PBS稀释4倍，保存4备用。2微孔板的抗体包被 首先将酶标板洗净，除第一列ABCD四孔外，

10、每孔加皮质醇抗体(1：15 000)200l，4过夜，次日弃去板中液体，并用冲洗液洗涤三次，甩干。包被板可保存1周。3将血清用测定缓冲液对倍稀释，置6010min，以破坏血清中皮质类固醇结合球蛋白(CBG)，取经处理后血清100l置于抗体包被的微孔内，然后加酶标记抗原100l (1：1 200)4过夜，次日弃去板中液体，用洗涤液冲洗3次并甩干，以下步骤同标准孔。4校正曲线 设8个标准孔分别含皮质醇0，0.625，1.25，2.5，5.0，10，20，40ng，加于被抗体包被的微孔中，均作复孔，按待测样品相同方法进行免疫反应，2对PBS孔中均未被抗体包被，其中一对孔为总酶结合物读数孔，另一对为非

11、特异性吸附孔(NSB)。5荧光显示 各孔加0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)100l，再加0.5%HPPA和0.05%H2O2 1：1(v/v)底物100l，37 2h，加2mol/L NaOH 50l终止反应。用SFF-200型酶免荧光仪测定荧光强度，激发波长为320nm，发射波长为405nm。【计算】 以不同标准浓度的结合率(B%)绘出校正曲线。 样品结合率B%在校正曲线上查得ng数2(104/103)即得血清皮质醇ng值。 【参考范围】 晨8时为7923g/L。【临床意义】1皮质醇增多症 血浆和尿皮质醇含量明显增高，血浆昼夜节律变化消失。2异位产生ACTH的肿瘤 如

12、燕麦型肺癌，胰、甲状腺、甲状旁腺、卵巢、睾丸、大肠、胆囊、乳腺以及纵隔瘤等癌肿组织具有分泌ACTH样物质的功能，促使肾上腺皮质合成皮质醇，血浆中皮质醇含量显著升高。3垂体前叶功能亢进症 由于垂体前叶促激素的大量分泌，靶腺增生，血浆和尿皮质醇可升高。4肾上腺皮质功能低下 如阿狄森病、席汉综合征，血浆和尿皮质醇含量减少。5长期使用类固醇激素可通过负反馈抑制ACTH分泌，使肾上腺皮质处于抑制或萎缩状态，则血浆和尿液皮质醇含量减少。6单纯性肥胖 血浆和尿液皮质醇含量略高或在正常范围。7先天性肾上腺皮质增生症 因体内缺乏某种酶如C2022断裂酶3-脱氢酶，17-羟化酶11-羟化酶等使皮质醇合成障碍，而皮

13、质醇产生减少。【注意事项】 1血浆(清)皮质醇测定，是检测包括蛋白结合和游离两部分的总皮质醇浓度，并不能排除CBG、白蛋白浓度改变等各种影响皮质醇蛋白结合率因素对游离皮质醇浓度的影响，因此其浓度不一定和游离皮质醇浓度平行。正常人皮质醇的分泌存在昼夜节律，可由此导致单次取样测定因取样时间在分泌峰或谷浓度，产生假阳性或假阴性结果。皮质醇增多症者，该昼夜节律多消失，可为诊断依据之一。故现在均主张分别在早晨8点及午夜12点分别取血测定，代表峰浓度、谷浓度。并且为避免因住院、静脉穿刺等产生应激性皮质醇分泌因素的影响，采血宜在住院至少3d后，并以保留式静脉取血套管进行。224h UFC测定不受昼夜节律影响

14、，并可靠地反映游离皮质醇水平。特别是当皮质醇增多症时，血皮质醇浓度超过CBG结合容量，游离皮质醇浓度将不成比例地升高，UFC亦将出现较血浆总皮质醇、尿17-OHCS和17-ks更明显的改变。故在诊断皮质醇增多症上，24h UFC测定更为敏感可靠。但本测定除同样受上述影响血浆皮质醇测定的因素影响外，还受肾功能影响。若同时测定尿肌酐排泄量，以24h UFC/24h尿肌酐表示，可在一定程度上排除肾功能对24h UFC测定的影响。【评价】1校正曲线范围为040ng，灵敏度为0.5ng，平均回收率95.1%3.7%，批内变系数为6.2%，批间变异系数为12.4%。与Serono酶标法比较，相关性良好，较

15、传统的放射免疫法简单方便，快速，没有同位素污染。2使用C21-半琥珀酸皮质醇，以辣根过氧化物酶直接标记在碳21位上，这与半抗原在21位接牛血清白蛋白再制备抗体有良好的结合反应，该酶标物既保持了酶的活性又具有与皮质醇抗体结合的免疫活性，并与血中游离皮质醇抗原相竞争。本法抗体的合理稀释度为1.51042.0104，酶结合物的合理稀释度为1.21031.5103。3在酶反应中使用HPPAH2O2底物，经HRP作用后产物在320nm光的激发下能发射405nm波长的荧光，该荧光物质能稳定24h，荧光基质HPPA和酶标比色所应用的对甲基苯酚相比，前者HPPA可提高灵敏度，又没有对甲基苯酚的致癌作用。(刘忠

16、民)实验73 时间分辨免疫法测定血浆雌二醇【原理】 雌二醇(estrodiol E2)是由18个碳原子所组成的一种女性甾体类激素。用时间分辨荧光免疫法(Time resolved fluorescence immunoassay，TRFIA)测定的模式可以采用第二抗体固相法。即样品中的E2和Eu3+铕标记的E2衍生物共同竞争性地和限量抗体结合。样品中的E2浓度升高，抗体和Eu3+标记E2结合量降低。反之，样品中的E2浓度降低，抗体和Eu3+标记E2结合的量增加。第二抗体作为一种特异性的分离剂。测定固相上Eu3+标记物的量，便可算出样品中E2的浓度。【试剂】 1固相第二抗体制备 取高滴度羊抗鼠I

17、gG抗血清，用盐析法和离子交换柱层析法提取IgG。将抗鼠第二抗体IgG用包被缓冲液配制成20g/ml。向经活化的微量滴定条每孔加200l，4过夜，洗涤2次，每孔加1%戊二醛液200l，放室温1h后洗涤2次，再次加第二抗体IgG液200l进行第二次包被。每孔加10g/L BSA液封闭4h，洗涤后放4保存。2E2-6-BSA Eu3+标记 取E2-6-BSA(Sigma 产品，也可自行合成)1mg溶于0.15mol/L NaCl液500l中，加入Eu3+-对-异硫氰酸苯基-DTTA (Pharmacia Wallac产品)25g，即刻用0.1mol/L NaOH液调pH至pH9.0，4反应过夜。将

18、反应液加至1cm30cm SephadexG-50柱中分离，50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.75)洗脱。在紫外280nm检测下收集蛋白峰洗脱液。加适量保护蛋白和防腐剂后，分装，置20保存。3Tris-HCl缓冲液 50mmol/L Tris-HCl(pH7.75)，含NaCl 18.5g/L，BSA 2.5g/L，三氯醋酸10g/L，NaN3 0.5g/L，EDTA-Na2 8mg/L，Tween-40 0.2g/L。415mol/L标准E2贮存液 称取准确E2量，用无水乙醇适量溶解并定容，4可长期保存。5标准E2应用液 取去甾体激素血清，加入15mol/L标准E2贮存液，使

19、浓度为0.1，0.5，2.5，5，10，15mol/L。分装每瓶250l，冷冻干燥，4保存。临用前用250l蒸馏水溶解。6抗E2单克隆抗体 按预先经125I RIA法所测得的滴度，用Tris-HCl缓冲液稀释，临用前配制。7增强液。【操作步骤】1将固相抗鼠IgG微量滴定条用洗涤液洗2次，按表12-1加入样品和试剂。表12-1 血清E2测定加液程序(单位l)NSB管S0管S16管样品管去激素血清2525标准E2液25待测血清25Eu3+-E2液50505050抗血清100100100缓冲液1002在室温下振荡反应4h，洗涤10次后加增强液200l，振荡15min，放置15min，测量荧光强度，从

20、所编程序直接打印出血清中E2浓度。【参考范围】男性：01.6(=0.08) (nmol/L)女性： 滤泡期0.10.61(=0.2) (nmol/L) 排卵期0.571.62(=0.95) (nmol/L) 黄体期0.20.73(=0.43) (nmol/L)女性绝经后00.16(=0.04) (nmol/L)孕妇(7-9个月)20130(nmol/L)【临床意义】1雌二醇测定是检查下丘脑-垂体-性腺轴的功能指标之一，主要用于青春期前内分泌疾病的鉴别诊断和闭经或月经异常时卵巢功能评价的指标。2 血清雌二醇测定也可作为男性睾丸或肝脏肿瘤等疾病的诊断指标之一。【注意事项】1本法直接取血清测定简便易

21、行，适合大量样品检测。但反应液中三氯醋酸钠作为E2和蛋白结合的阻断剂，浓度要适宜，否则将影响结果的准确性。2血清样品也可经二氯甲烷提取，有机相蒸干后溶于缓冲液中，然后按本法测定，排除了蛋白的干扰，缓冲液中不必加三氯醋酸蛋白变性剂，方法准确性较高。【评价】1取4份不同浓度E2血清(0.066.65nmol/L)检测本法精密度。批内CV3.3%11.7%(n=12)，批间CV3.8%9.1%(n=6)。2以零标准孔CPS2SD 计算灵敏度，本法最小检出值为0.05nmol/L。校正曲线量程0.115nmol/L。 实验74 尿17-酮类固醇测定【原理】 17-酮类固醇(17-ketosteroid

22、s，17-ks)是肾上腺皮质激素及雄性激素的代谢产物，它们都是环戊烷多氢菲的衍生物，在第17位碳原子上都有一酮基。这类化合物主要为雄酮、表雄酮、去氢表雄酮和原胆烷醇酮等，大部分结合成为水溶性的葡萄糖醛酸酯或硫酸酯。它们必须经过酸水解成游离的类固醇后，再用有机溶剂提取，经过洗涤除去酸类与酚类物质，利用17-酮类固醇分子结构中酮-亚甲基(COCH2)能在碱性溶液中与间二硝基苯作用生成紫红色化合物(Zimmermann反应)，在520nm波长处有一吸收峰，可与标准同时操作进行比色测定。【试剂】1浓盐酸(AR)。2乙醚(AR)。3去醛乙醇 无水乙醇1 000ml，加入4g盐酸间苯二胺，充分混匀后，暗处

23、静置一周，每天振摇2次，到期进行蒸馏，弃去开始馏出与最后剩余部分各50ml，收集中间部分所得乙醇，置棕色瓶中保存。40.12mol/L间二硝基苯乙醇溶液 称取纯化的间二硝基苯2g，溶于去醛无水乙醇内，定容至100ml。冰箱避光保存。间二硝基苯必须重结晶提纯，处理方法如下：取间二硝基苯20g，加95%乙醇150ml，加温至40，使其溶解。加2mol/L NaOH溶液100ml，静置5min。在室温下徐徐加蒸馏水2 500ml，边加边摇，静置即可出现针状白色结晶，用布氏漏斗收集沉淀，并用蒸馏水洗涤后吸干，沉淀用无水乙醇80120ml再结晶2次，纯化的结晶洁白无色，熔点90.591。5雄酮标准溶液(

24、100g/ml) 将雄酮(GR)置于干燥器中至少48h，精确称取雄酮10mg，置于100ml容量瓶中，用去醛乙醇溶解并定容。此液不能久存，必须分装于洁净的中号试管中，每管0.2ml(含20g)，置37温箱中烘干，置暗处保存，每次测定时取出一管使用。65mol/L KOH 溶液。770%去醛乙醇溶液 取去醛乙醇70ml，加蒸馏水至100ml。82mol/L NaOH溶液。【操作步骤】1标本收集 收集24h尿液于洁净的容器中，预加浓盐酸5ml防腐，并记录尿液总量。2水解 取24h混合尿液5ml，置试管中，加浓盐酸1.5ml，在沸水中煮沸20min，取出，置冷水中冷却。3提取 将上述水解液倒入30m

25、l分液漏斗中，加乙醚约10ml，振摇2min，静置分层以后，弃下层尿液，加5ml 2mol/L NaOH于分液漏斗中，振摇1min，以除去酸性酚类干扰物质，静置分层后，弃去下层NaOH液，再加蒸馏水5ml洗涤二次，弃去下层水液，于4045水浴中蒸干。此管即为测定管。4标准管 取上述分装于15mm150mm试管中烘干的标准管一支作标准管。5显色 取测定、标准、空白3支试管，按表12-2操作。表12-2 尿17-酮类固醇测定步骤加入物(ml)空白管标准管测定管去醛乙醇0.20.20.20.12mol/L间二硝基苯乙醇溶液0.20.20.25mol/L KOH溶液0.30.30.3 混匀, 置37水

26、浴20min，避光70%去醛乙醇溶液5.05.05.0各管混匀，1 000r/min离心5min，上层液移入比色杯中，在波长520nm处，以空白管调零，读取各管的吸光度。【计算】尿17-ks(mg/24h)= 按雄酮分子量288.41计算，17KS(mol/24h)= mg/24h3.47【参考范围】成年男性: 28.561.8mol/24h(8.217.8mg/24h)；成年女性：20.852.1mol/24h (6.015.0 mg/24h)。【临床意义】 尿17-ks排泄量与性别年龄有关：男性高于女性；同性中，儿童、老年人偏低，中壮年期较高。1尿17-ks增高 见于肾上腺皮质功能亢进、垂

27、体肿瘤和睾丸间质细胞肿瘤等。雄激素、ACTH等药物的应用也会导致尿17-ks含量增高。2尿17-ks减低 见于肾上腺功能减退、性功能减退及某些慢性病如结核、肝病等。【注意事项】1由于对光敏感显色不稳定，宜放暗处，因此加完试剂后需在1020min内完成比色。2乙醚提取时如出现乳化现象而分不清时，可加氯化钠少许，振摇后即分清。3本实验所用乙醚、去醛乙醇，应远离火源，保证安全。4乙醚蒸干后，管内不应有水滴，否则影响显色。5病人在留尿前，禁用安神、普鲁卡因酰胺、冬眠灵和类固醇激素等，以减少干扰。6如室温过低，比色液可出现混浊，应在比色前加饱和NaCl溶液0.1ml, 使浊度消失后再进行比色。【评价】

28、尿17-ks测定在国际上还没有统一的参考方法，在国内推荐的测定方法即Zimmermann反应。本方法检测范围，从220mg/L之间基本呈直线关系。显色如果超过40min，吸光度逐渐下降，影响测定的准确性。该方法回收率为87.6%89.2%，批内变异系数为9.75%，因此本方法不如直接测定单个酮类固醇，但目前国内有不少实验室还采用Zimmermann反应测尿-17ks。实验75 尿17-羟皮质类固醇测定【原理】 尿17-羟皮质类固醇(17-hydroxycorticosteroid，17-OHCS)为肾上腺皮质所分泌的激素及其代谢产物，主要有皮质醇、四氢皮质醇、皮质素、四氢皮质素等，均为环戊烷多

29、氢菲的衍生物，在第17位碳原子上有一个羟基，第20位碳原子上有一个酮基。在酸性条件下，促使17-羟类固醇水溶性下降，用10:1氯仿-正丁醇混合液将尿中结合型和游离型17-羟类固醇自尿中提取后，在尿提取物中加入盐酸苯肼和硫酸，使17-羟类固醇与盐酸苯肼作用，生成黄色苯肼衍生物(Porter-Silber反应)，此结果减去硫酸与其他非尿17-羟类固醇显色物所产生的空白颜色，与标准液同样处理比色，求其含量。【试剂】1氯仿(AR) 若空白管颜色过高，氯仿应精制，方法如下：用分析纯浓硫酸洗至硫酸无色，再用蒸馏水洗至中性。2正丁醇 取正丁醇1 000ml，加10mol/L硫酸调节pH到1，加盐酸苯肼100

30、mg，混匀室温放置过夜。在砂浴上重蒸馏，弃去头尾各100ml，收集中段沸点117的正丁醇。3无水硫酸铵(AR)。4盐酸苯肼硫酸溶液 取纯化的盐酸苯肼65mg，加10mol/L硫酸100ml，加氯化钠2g，置冰箱可用1个月。盐酸苯肼精制方法如下：取分析纯盐酸苯肼10g，用无水乙醇400ml隔水加热溶解，室温冷却置冰箱内12h即有结晶析出，布氏漏斗过滤，重复结晶23次，直至无水乙醇无色，得到白色结晶，37烘干，保存于棕色瓶中。5硫酸溶液10mol/L 取浓硫酸(AR)280ml缓缓加入到蒸馏水220ml中。6皮质醇标准液(100g/ml) 精确称取皮质醇(氢化可的松)10mg，用无水乙醇约10ml溶解后，转移入100ml容量瓶中，加氯仿-正丁醇定容。7氯仿正丁醇混合液 比例为10:1。【操作步骤】1标本收集 收集24h尿液于洁净的容器中，预加浓盐酸5ml防腐，并记录尿液总量。2提取 取尿液3ml于带塞烧瓶中，加10mol/L硫酸2滴，使尿液pH调至1，加硫酸铵3g，摇匀，再加氯仿正丁醇混合液21ml，加塞后用力振摇3min，静置待分层后，用滴管吸取上层尿液，留下层氯仿-正丁醇提取液备用。3标准管 将皮质醇标准液(100g/ml)分装于15ml带塞试管中，每管加0.2ml，置室温中干燥后，用塞塞好，放暗处备用。4显色 取15ml带塞试管6支，其中C管和D管为含皮质醇的标准管，按表