血凝抑制.docx

1、血凝抑制血凝抑制（HI）试验流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体的结构，HA试验由此得名。HA蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。HA-HI试验的优点是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法，可用来鉴定所有的流感病毒分离株，可用来检测禽血清中的感染或免疫抗体。它的缺点是只有当抗原和抗体HA亚型相一致时才能出现HI象，各亚型间无明显交叉反应；除鸡血清以外，用鸡红细胞

2、检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异凝集素，对于其它禽种，也可以考虑选用在调查研究中的禽种红细胞；需要在每次试验时进行抗原标准化；需要正确判读的技能。1 阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4保存备用。2 10%和1%鸡红细胞液的制备2.1采血 用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约24mL，与阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。2

3、.2 洗涤鸡红细胞 将离心管中的血液经15001800 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经15001800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4保存备用，不超过5天。2.3 10%鸡红细胞悬液 取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心15001800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。2.4 1%鸡红细胞液 取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1

4、 mL，加入9 mL生理盐水，混合均匀即可。3 抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）3.1 在微量反应板的1孔12孔均加入0.025mL PBS，换滴头。3.2吸取0.025mL病毒悬液（如感染性鸡胚尿囊液）加入第l孔，混匀。3.3从第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。3.4每孔再加入0.025mL PBS。3.5每孔均加入0.025mL 体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）见附录B。3.6振荡混匀，在室温（2025）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高

5、，可置4环境下反应1小时）。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。3.7结果判定 将板倾斜，观察血凝板，判读结果（见下表）。表1：血凝试验结果判读标准类别孔 底 所 见结果12345红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细胞凝集红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集+-能使红细胞完全凝集（100%凝集，+）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）。注意对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次检验无效。4 血凝抑制（HI）试验（微量法）4.1

6、 根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。4.2 在微量反应板的1孔11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。4.3 吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。4.4 1孔11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温（约20）静置至少30min。4.5 每孔加入0.025mL体积分数为1%的

7、鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20，若环境温度太高可置4条件下进行），对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。4.6 结果判定以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于21og2判定HI试验阴性；HI价等于31og2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于41og2为阳性。大于或等于11og2存在强度感染，需结合流行病学调查。3许多研究者认为来源不同个体鸡只的红细胞对新城疫病毒的敏感性不同，一般HI滴度相差12个滴度。所以试验时最好用34只鸡的红细胞。红细胞的浓度对

8、本试验结果也有很大的影响，一般红细胞浓度增加（0.5%1%），HA滴度下降,HI滴度有所上升。4在血凝和血凝抑制试验中，当红细胞出现凝集以后，由于新城疫病毒囊膜上含有神经氨酸酶，其裂解红细胞膜受体上的神经氨酸，结果使病毒粒子重新脱落到液体中，红细胞凝集现象消失，此过程称为洗脱。试验时应注意，以免判定错误。5试验用稀释液的PH对试验有影响，稀释液PH 7.8凝集的红细胞洗脱加快。附件二反向间接血凝试验（RIHA）1 材料准备1.1 96孔微型聚乙烯血凝滴定板（110度），微量振荡器或微型混合器，0.025 mL、0.05mL稀释用滴管、乳胶吸头或25L、50L移液加样器。1.2 pH7.6、0.

9、05mol/L磷酸缓冲液（pH7.6、0.05mol/L PB），pH7.6、50%丙三醇磷酸缓冲液（GPB），pH7.2、0.11mol/L磷酸缓冲液（pH7.2、0.11mol/L PB），配制方法见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）猪水泡病诊断技术附录A（规范性附录）。1.3 稀释液I、稀释液II，配制方法见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）猪水泡病诊断技术附录B（规范性附录）。1.4 标准抗原、阳性血清，由指定单位提供，按说明书使用和保存。1.5敏化红细胞诊断液：由指定单位提供，效价滴定见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003

10、）猪水泡病诊断技术附录C（规范性附录）。1.6 被检材料处理方法见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）猪水泡病诊断技术附录E（规范性附录）。2 操作方法2.1 使用标准抗原进行口蹄疫A、O、C、Asia-I型及与猪水泡病鉴别诊断。2.1.1被检样品的稀释：把8只试管排列于试管架上，自第1管开始由左至右用稀释液I作二倍连续稀释（即1:6、1:12、1:241:768）,每管容积0.5 mL。2.1.2按下述滴加被检样品和对照：2.1.2.1在血凝滴定板上的第一至五排，每排的第8孔滴加第8管稀释被检样品0.05 mL，每排的第7孔滴加第7管稀释被检样品0.05 mL，以此类推至

11、第1孔。2.1.2.2每排的第9 孔滴加稀释液I 0.05 mL,作为稀释液对照。2.1.2.3每排的第10孔按顺序分别滴加口蹄疫A、O、C、Asia-I型和猪水泡病标准抗原（1：30稀释）各0.05 mL，作为阳性对照。2.1.3 滴加敏化红细胞诊断液：先将敏化红细胞诊断液摇匀，于滴定板第一至五排的第110孔分别滴加口蹄疫A、O、C、Asia-I型和猪水泡病敏化红细胞诊断液，每孔0.025 mL，置微量振荡器上振荡1分钟2分钟,2035放置1.5小时2小时后判定结果。2.2使用标准阳性血清进行口蹄疫O型及与猪水泡病鉴别诊断。2.2.1每份被检样品作四排、每孔先各加入25L稀释液II。2.2.

12、2每排第1孔各加被检样品25L，然后分别由左至右作二倍连续稀释至第7孔（竖板）或第11孔（横板）。每排最后孔留作稀释液对照。2.2.3滴加标准阳性血清：在第一、三排每孔加入25L稀释液II；第二排每孔加入25L稀释至1:20的口蹄疫O型标准阳性血清；第四排每孔加入25L稀释至1:100的猪水泡病标准阳性血清；置微型混合器上振荡1分钟2分钟，加盖置37作用30分钟。2.2.4滴加敏化红细胞诊断液：在第一和第二排每孔加入口蹄疫O型敏化红细胞诊断液25L；第三和第四排每孔加入猪水泡病敏化红细胞诊断液25L；置微型混合器上振荡1分钟2分钟，加盖2035放置2小时后判定结果。3 结果判定3.1按以下标准

13、判定红细胞凝集程度：“+”100%完全凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围；“+”75%凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围，但孔底中心有红细胞形成的针尖大的小点；“+”50%凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，孔底有一红细胞沉下的小点；“+”25%凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，但大部分红细胞已沉积于孔底；“”不凝集，红细胞完全沉积于孔底成一圆点。3.2操作方法2.1的结果判定：稀释液I对照孔不凝集、标准抗原阳性孔凝集试验方成立。3.2.1若只第一排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为口蹄疫A型；若只第二排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为口蹄疫O型；以此类推。若只第五排孔凝集，其余四排孔

14、不凝集，则被检样品为猪水泡病3.2.2致红细胞50%凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。3.2.3如出现2排以上孔的凝集，以某排孔的凝集效价高于其余排孔的凝集效价2个对数（以2为底）浓度以上者即可判为阳性，其余判为阴性。3.3操作方法2.2的结果判定：稀释液II对照孔不凝集试验方可成立。3.3.3.1若第一排出现2孔以上的凝集（+以上），且第二排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑制，第三、四排不出现凝集判为口蹄疫O型阳性。若第三排出现2孔以上的凝集（+以上），且第四排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑制，第一、二排不出现凝集则判为猪水泡病阳性。3.3.3.2致红细胞50%凝集的被检样品最高稀释度为其

15、凝集效价。附件三正向间接血凝试验（IHA）1 原理 用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验（IHA）。 抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下会形成抗原复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性。这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。2 适用范围 主要用于检测O型口蹄疫免疫动物血清抗体效价。3 试验器材和试剂3.1 96孔110V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板3.2 微量移液器（50L 25L）取液塑咀3.3 微量振荡器3.4

16、O型口蹄疫血凝抗原3.5 O型口蹄疫阴性对照血清3.6 O型口蹄疫阳性对照血清3.7 稀释液3.8 待检血清（每头约0.5ml血清即可）56水浴灭活30分钟4 试验方法4.1 加稀释液 在血凝板上1-6排的1-9孔；第7排的1-4孔第6-7孔；第8排的1-12孔各加稀释液50L。4.2 稀释待检血清 取1号待检血清50L加入第1排第1孔，并将塑咀插入孔底，右手拇指轻压弹簧1-2次混匀（避免产生过多的气泡），从该孔取出50L移入第2孔，混匀后取出50L移入第3 孔直至第9孔混匀后取出50L丢弃。此时第1排1-9孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为：1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:

17、64、1:128、1:256、1:512。 取2号待检血清加入第2排；取3号待检血清加入第3排均按上法稀释，注意！每取一份血清时，必须更换塑咀一个。4.3 稀释阴性对照血清 在血凝板的第7排第1孔加阴性血清50L，对倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50L丢弃。此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2、1:4、1:8、1:16。第6-7孔为稀释液对照。4.4 稀释阳性对照血清 在血凝板的第8排第1孔加阳性血清50L，对倍数稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50L丢弃。此时阳性血清的稀释倍数依次为1：2-1：4096。4.5 加血凝抗原 被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加

18、O型血凝抗原（充分摇匀，瓶底应无血球沉淀）25L。4.6 振荡混匀 将血凝板置于微量振荡器上1-2分钟，如无振荡器，用手轻拍混匀亦可，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下或37下静置1.5-2小时判定结果，也可延至翌日判定。4.7 判定标准 移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:16孔，稀释液对照孔，均应无凝集（血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点），或仅出现“+”凝集（血球大部沉于孔底，边缘稍有少量血球悬浮）。 阳性血清对照1:2-1:256各孔应出现“+”“+”凝集为合格（少量血球沉入孔底，大部血球悬浮于孔内）。在对照孔合格的前

19、提下，再观察待检血清各孔，以呈现“+”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清1-5孔呈现“+”“+”凝集，6-7孔呈现“+”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集，那么就可判定该份血清的口蹄疫抗体效价为1:128。接种口蹄疫疫苗的猪群免疫抗体效价达到1:128（即第7孔）牛群、羊群免疫抗体效价达到1:256（第8孔）呈现“+”凝集为免疫合格。5 检测试剂的性状、规格5.1 性状5.1.1 液体血凝抗原：摇匀呈棕红色（或咖啡色），静置后，血球逐渐沉入瓶底。5.1.2 阴性对照血清：淡黄色清亮稍带粘性的液体。5.1.3 阳性对照血清：微红或淡色稍混浊带粘性的液体。5.1.4 稀

20、释液：淡黄或无色透明液体，低温下放置，瓶底易析出少量结晶，在水浴中加温后即可全溶，不影响使用。5.2 包装5.2.1 液体血凝抗原：摇匀后即可使用，5ml/瓶。5.2.2 阴性血清：1ml/瓶，直接稀释使用。5.2.3 阳性血清：1ml/瓶，直接稀释使用。5.2.4 稀释液：100 ml/瓶，直接使用，4-8保存。5.2.5 保存条件及保存期5.2.5.1 液体血凝抗原：4-8保存（切勿冻结），保存期3个月。5.2.5.2 阴性对照血清：-15-20保存，有效期1年。5.2.5.3 阳性对照血清：-15-20保存，有效期1年。6 注意事项6.1 为使检测获得正确结果，请在检测前仔细阅读说明书。

21、6.2 严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。6.3 勿用90和130血凝板，严禁使用一次性血凝板，以免误判结果。 6.4 用过的血凝板应及时在水龙头冲净血球。再用蒸馏水或去离子水冲洗2次，甩干水份放37恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒，37干燥备用。血凝板应浸泡在洗液中（浓硫酸与重铬酸钾按1：1混合），48小时捞出后清水冲净。6.5 每次检测只做一份阴性、阳性和稀释液对照。“-”表示完全不凝集或0-10%血球凝集。“+”表示10-25%血球凝集 “+”表示75%血球凝集。“+”表示50%血球凝集 “+”表示90-100%血球凝集。6.6 用不同批次的血凝抗原检测同一份血清时，应事先用阳性血清准确测定各批次血凝抗原的效价，取抗原效价相同或相近的血凝抗原检测待检血清抗体水平的结果是基本一致的，如果血凝抗原效价差别很大用来检测同一血清样品，肯定会出现检测结果不一致。6.7 收到本试剂盒时，应立即打开包装，取出血凝抗原瓶，用力摇动，使粘附在瓶盖上的红细胞摇下，否则易出现沉渣，影响使用效果。